Tack för att du besöker nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder den senaste webbläsarversionen (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). För att säkerställa fortsatt stöd kommer webbplatsen dessutom att vara fri från stilar och JavaScript.
Skelettmuskulatur är en heterogen vävnad som huvudsakligen består av myofibriller, vilka hos människor vanligtvis klassificeras i tre typer: en "långsam" (typ 1) och två "snabba" (typ 2A och 2X). Heterogeniteten mellan och inom traditionella myofibriltyper är dock fortfarande dåligt förstådd. Vi tillämpade transkriptomiska och proteomiska metoder på 1050 respektive 1038 individuella myofibriller från mänsklig vastus lateralis. Den proteomiska studien inkluderade män, och den transkriptomiska studien inkluderade 10 män och 2 kvinnor. Förutom myosin tungkedje-isoformer identifierade vi metaboliska proteiner, ribosomala proteiner och cellulära junctionalproteiner som källor till multidimensionell intermyofibrilvariabilitet. Trots identifieringen av kluster av långsamma och snabba fibrer tyder våra data på att typ 2X-fibrer fenotypiskt sett inte kan skiljas från andra snabba fibrer. Dessutom är myosin tungkedjebaserad klassificering otillräcklig för att beskriva myofiberfenotypen vid nemalinmyopatier. Sammantaget tyder våra data på flerdimensionell myofiberheterogenitet, med variationskällor som sträcker sig bortom myosins tunga kedjeisoformer.
Cellulär heterogenitet är en inneboende egenskap hos alla biologiska system, vilket gör att celler kan specialisera sig för att möta de olika behoven hos vävnader och celler.1 Den traditionella synen på heterogenitet i skelettmuskelfibrer har varit att motorneuroner definierar fibertypen inom en motorisk enhet, och att fibertypen (dvs. typ 1, typ 2A och typ 2X hos människor) bestäms av egenskaperna hos myosin tunga kedjans (MYH) isoformer.2 Detta baserades initialt på deras pH ATPas-instabilitet,3,4 och senare på deras molekylära uttryck av MYH.5 Men med identifieringen och efterföljande acceptans av "blandade" fibrer som samuttrycker flera MYH i varierande proportioner, ses skelettmuskelfibrer i allt högre grad som ett kontinuum snarare än som distinkta fibertyper.6 Trots detta förlitar sig fältet fortfarande starkt på MYH som den primära klassificeraren för myofiberklassificering, en syn som sannolikt påverkas av begränsningarna och betydande fördomar i tidiga gnagarstudier vars MYH-uttrycksprofiler och utbud av fibertyper skiljer sig från de hos människor.2 Situationen kompliceras ytterligare av det faktum att olika mänskliga skelettmuskler uppvisar ett varierat utbud av fibertyper.7 Den vastus lateralis är en blandmuskel med en intermediär (och därför representativ) MYH-uttrycksprofil.7 Dessutom gör dess enkla provtagning den till den bäst studerade muskeln hos människor.
Således är opartisk undersökning av skelettmuskelfibrers mångfald med hjälp av kraftfulla "omics"-verktyg avgörande men också utmanande, delvis på grund av skelettmuskelfibrernas flerkärniga natur. Emellertid har transkriptomik8,9 och proteomik10-tekniker genomgått en revolution i känslighet de senaste åren på grund av olika tekniska framsteg, vilket möjliggör analys av skelettmuskulatur med enfiberupplösning. Som ett resultat har betydande framsteg gjorts när det gäller att karakterisera enfibers mångfald och deras svar på atrofiska stimuli och åldrande11,12,13,14,15,16,17,18. Viktigt är att dessa tekniska framsteg har kliniska tillämpningar, vilket möjliggör en mer detaljerad och exakt karakterisering av sjukdomsassocierad dysreglering. Till exempel är patofysiologin för nemalinmyopati, en av de vanligaste ärftliga muskelsjukdomarna (MIM 605355 och MIM 161800), komplex och förvirrande.19,20 Därför skulle en bättre karakterisering av dysregleringen av skelettmuskelfibrer kunna leda till betydande framsteg i vår förståelse av denna sjukdom.
Vi utvecklade metoder för transkriptomisk och proteomisk analys av enskilda skelettmuskelfibrer, manuellt isolerade från mänskliga biopsiprover, och tillämpade dem på tusentals fibrer, vilket gjorde det möjligt för oss att undersöka den cellulära heterogeniteten hos mänskliga skelettmuskelfibrer. Under detta arbete demonstrerade vi kraften i transkriptomisk och proteomisk fenotypning av muskelfibrer och identifierade metaboliska, ribosomala och cellulära junktionsproteiner som betydande källor till interfibervariabilitet. Dessutom, med hjälp av detta proteomiska arbetsflöde, karakteriserade vi den kliniska relevansen av nematodmyopati i enskilda skelettmuskelfibrer, vilket avslöjade en koordinerad förskjutning mot icke-oxidativa fibrer oberoende av fibertyp baserat på MYH.
För att undersöka heterogeniteten hos mänskliga skelettmuskelfibrer utvecklade vi två arbetsflöden för att möjliggöra transkriptom- och proteomanalys av enskilda skelettmuskelfibrer (Figur 1A och kompletterande Figur 1A). Vi utvecklade och optimerade flera metodologiska steg, från provlagring och bevarande av RNA- och proteinintegritet till att optimera genomströmningen för varje metod. För transkriptomanalys uppnåddes detta genom att infoga provspecifika molekylära streckkoder i det initiala steget av omvänd transkription, vilket möjliggjorde att 96 fibrer poolades för effektiv nedströmsbearbetning. Djupare sekvensering (±1 miljon avläsningar per fiber) jämfört med traditionella encellsmetoder berikade transkriptomdata ytterligare.21 För proteomik använde vi en kort kromatografisk gradient (21 minuter) i kombination med DIA-PASEF-datainsamling på en timsTOF-masspektrometer för att optimera proteomdjupet samtidigt som hög genomströmning bibehölls. 22,23 För att undersöka heterogeniteten hos friska skelettmuskelfibrer karakteriserade vi transkriptomerna från 1 050 individuella fibrer från 14 friska vuxna donatorer och proteomerna från 1 038 fibrer från 5 friska vuxna donatorer (kompletterande tabell 1). I denna artikel kallas dessa dataset för transkriptomer respektive proteomer med 1 000 fibrer. Vår metod detekterade totalt 27 237 transkript och 2 983 proteiner i de transkriptomiska och proteomiska analyserna med 1 000 fibrer (figur 1A, kompletterande dataset 1–2). Efter att ha filtrerat de transkriptomiska och proteomiska dataseten för >1 000 detekterade gener och 50 % giltiga värden per fiber, utfördes efterföljande bioinformatiska analyser för 925 respektive 974 fibrer i transkriptomet och proteomet. Efter filtrering detekterades i genomsnitt 4257 ± 1557 gener och 2015 ± 234 proteiner (medelvärde ± SD) per fiber, med begränsad interindividuell variation (kompletterande figurer 1B–C, kompletterande dataset 3–4). Variabiliteten inom individen var dock mer uttalad bland deltagarna, troligen på grund av skillnader i RNA/proteinutbyte mellan fibrer med olika längder och tvärsnittsareor. För de flesta proteiner (>2000) var variationskoefficienten under 20 % (kompletterande figur 1D). Båda metoderna möjliggjorde infångning av ett brett dynamiskt omfång av transkript och proteiner med högt uttryckta signaturer viktiga för muskelkontraktion (t.ex. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (kompletterande figurer 1E–F). De flesta av de identifierade egenskaperna var gemensamma mellan de transkriptomiska och proteomiska dataseten (kompletterande figur 1G), och de genomsnittliga UMI/LFQ-intensiteterna för dessa egenskaper var relativt väl korrelerade (r = 0,52) (kompletterande figur 1H).
Arbetsflöde för transkriptomik och proteomik (skapat med BioRender.com). BD Dynamiska omfångskurvor för MYH7, MYH2 och MYH1, och beräknade tröskelvärden för fibertyptilldelning. E, F Fördelning av MYH-uttryck över fibrer i transkriptomik- och proteomikdataset. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP)-diagram för transkriptomik och proteomik färgade efter MYH-baserad fibertyp. I, J Funktionsdiagram som visar MYH7-, MYH2- och MYH1-uttryck i transkriptomik- och proteomikdataset.
Vi bestämde oss initialt för att tilldela MYH-baserad fibertyp till varje fiber med hjälp av en optimerad metod som utnyttjar den höga känsligheten och det dynamiska omfånget för MYH-uttryck i omics-dataset. Tidigare studier har använt godtyckliga tröskelvärden för att märka fibrer som ren typ 1, typ 2A, typ 2X eller blandad baserat på en fast procentandel av uttryck av olika MYH:er11,14,24. Vi använde en annan metod där uttrycket av varje fiber rankades efter de MYH:er vi använde för att typa fibrerna: MYH7, MYH2 och MYH1, motsvarande typ 1-, typ 2A- respektive typ 2X-fibrer. Vi beräknade sedan matematiskt den nedre inflexionspunkten för varje resulterande kurva och använde den som ett tröskelvärde för att tilldela fibrer som positiva (över tröskelvärdet) eller negativa (under tröskelvärdet) för varje MYH (Figur 1B–D). Dessa data visar att MYH7 (Figur 1B) och MYH2 (Figur 1C) har mer distinkta on/off-uttrycksprofiler på RNA-nivå jämfört med proteinnivå. På proteinnivå uttryckte faktiskt väldigt få fibrer inte MYH7, och ingen fiber hade 100 % MYH2-uttryck. Vi använde sedan förutbestämda uttryckströsklar för att tilldela MYH-baserade fibertyper till alla fibrer i varje dataset. Till exempel tilldelades MYH7+/MYH2-/MYH1- fibrer typ 1, medan MYH7-/MYH2+/MYH1+ fibrer tilldelades blandad typ 2A/2X (se kompletterande tabell 2 för en fullständig beskrivning). Genom att samla alla fibrer observerade vi en anmärkningsvärt likartad fördelning av MYH-baserade fibertyper på både RNA-nivå (Figur 1E) och proteinnivå (Figur 1F), medan den relativa sammansättningen av MYH-baserade fibertyper varierade mellan individer, som förväntat (Kompletterande figur 2A). De flesta fibrer klassificerades som antingen ren typ 1 (34–35 %) eller typ 2A (36–38 %), även om ett betydande antal blandade typ 2A/2X-fibrer också detekterades (16–19 %). En slående skillnad är att rena typ 2X-fibrer endast kunde detekteras på RNA-nivå, men inte på proteinnivå, vilket tyder på att snabbt MYH-uttryck åtminstone delvis regleras posttranskriptionellt.
Vi validerade vår proteomikbaserade MYH-fibertypningsmetod med hjälp av antikroppsbaserad dot blotting, och båda metoderna uppnådde 100 % överensstämmelse vid identifiering av rena typ 1- och typ 2A-fibrer (se kompletterande figur 2B). Den proteomikbaserade metoden var dock mer känslig och effektiv för att identifiera blandade fibrer och kvantifiera andelen av varje MYH-gen i varje fiber. Dessa data visar effektiviteten av att använda en objektiv, mycket känslig omikbaserad metod för att karakterisera skelettmuskelfibertyper.
Vi använde sedan den kombinerade informationen från transkriptomik och proteomik för att objektivt klassificera myofibrer baserat på deras kompletta transkriptom eller proteom. Med hjälp av UMAP-metoden (uniform manifold approximation and projection) för att reducera dimensionaliteten till sex huvudkomponenter (kompletterande figurer 3A–B) kunde vi visualisera myofibervariabiliteten i transkriptomet (figur 1G) och proteomet (figur 1H). Det är värt att notera att myofibrer inte grupperades efter deltagare (kompletterande figurer 3C–D) eller testdagar (kompletterande figur 3E) i vare sig transkriptomik- eller proteomik-dataseten, vilket tyder på att variationen i skelettmuskelfibrer inom individer är högre än variationen mellan individer. I UMAP-diagrammet framträdde två distinkta kluster som representerar "snabba" och "långsamma" myofibrer (figurer 1G–H). MYH7+ (långsamma) myofibrer var klustrade vid den positiva polen av UMAP1, medan MYH2+ och MYH1+ (snabba) myofibrer var klustrade vid den negativa polen av UMAP1 (Figur 1I–J). Emellertid gjordes ingen åtskillnad mellan snabba fibertyper (dvs. typ 2A, typ 2X eller blandade 2A/2X) baserat på MYH-uttryck, vilket tyder på att MYH1-uttrycket (Figur 1I–J) eller andra klassiska 2X myofibermarkörer såsom ACTN3- eller MYLK2-uttrycket (kompletterande figurer 4A–B) inte skiljer mellan olika myofibertyper när man betraktar hela transkriptomet eller proteomet. Jämfört med MYH2 och MYH7 var det dessutom få transkript eller proteiner som var positivt korrelerade med MYH1 (kompletterande figurer 4C–H), vilket tyder på att MYH1-förekomsten inte helt återspeglar myofibertranskriptomet/proteomet. Liknande slutsatser nåddes vid bedömningen av det blandade uttrycket av de tre MYH-isoformerna på UMAP-nivå (kompletterande figurer 4I–J). Således, medan 2X-fibrer kan identifieras på transkriptnivå baserat enbart på MYH-kvantifiering, kan MYH1+-fibrer inte särskiljas från andra snabba fibrer när man beaktar hela transkriptomet eller proteomet.
Som en inledande undersökning av heterogenitet hos långsamma fibrer utöver MYH, utvärderade vi fyra etablerade proteiner specifika för långsamma fibrer: TPM3, TNNT1, MYL3 och ATP2A22. Subtyper av långsamma fibrer uppvisade höga, men inte perfekta, Pearson-korrelationer med MYH7 i både transkriptomik (kompletterande figur 5A) och proteomik (kompletterande figur 5B). Cirka 25 % respektive 33 % av de långsamma fibrerna klassificerades inte som rena långsamma fibrer av alla gen-/proteinsubtyper i transkriptomik (kompletterande figur 5C) respektive proteomik (kompletterande figur 5D). Därför introducerar klassificering av långsamma fibrer baserad på flera gen-/proteinsubtyper ytterligare komplexitet, även för proteiner som är kända för att vara fibertypspecifika. Detta tyder på att fiberklassificering baserad på isoformer av en enda gen-/proteinfamilj kanske inte tillräckligt återspeglar den verkliga heterogeniteten hos skelettmuskelfibrer.
För att ytterligare utforska den fenotypiska variationen hos mänskliga skelettmuskelfibrer i skala av hela omics-modellen, utförde vi opartisk dimensionalitetsreduktion av data med hjälp av principal component analysis (PCA) (Figur 2A). I likhet med UMAP-diagram påverkade varken deltagaren eller testdagen fiberklustringen på PCA-nivå (kompletterande figurer 6A–C). I båda datamängderna förklarades MYH-baserad fibertyp av PC2, som visade ett kluster av långsamt ryckade typ 1-fibrer och ett andra kluster innehållande snabbt ryckade typ 2A-, typ 2X- och blandade 2A/2X-fibrer (Figur 2A). I båda datamängderna var dessa två kluster sammankopplade av ett litet antal blandade typ 1/2A-fibrer. Som förväntat bekräftade överrepresentationsanalys av de viktigaste PC-drivarna att PC2 drevs av kontraktila och metaboliska signaturer (Figur 2B och kompletterande figurer 6D–E, kompletterande datamängder 5–6). Sammantaget befanns MYH-baserad fibertyp vara tillräcklig för att förklara kontinuerlig variation längs PC2, med undantag för så kallade 2X-fibrer som var fördelade över hela transkriptomet inom det snabba klustret.
A. Principal component analysis (PCA)-diagram av transkriptom- och proteomdataset färgade efter fibertyp baserat på MYH. B. Anrikningsanalys av transkript- och proteindrivare i PC2 och PC1. Statistisk analys utfördes med hjälp av clusterProfiler-paketet och Benjamini-Hochberg-justerade p-värden. C, D. PCA-diagram färgade enligt intercellulära adhesionsgenontologitermer (GO) i transkriptomet och kostamer-GO-termer i proteomet. Pilar representerar transkript- och proteindrivare och deras riktningar. E, F. Uniform manifold approximation and projection (UMAP)-diagram över kliniskt relevanta egenskaper som visar uttrycksgradienter oberoende av långsam/snabb fibertyp. G, H. Korrelationer mellan PC2- och PC1-drivare i transkriptomer och proteom.
Oväntat förklarade MYH-baserad myofibertyp endast den näst högsta graden av variation (PC2), vilket tyder på att andra biologiska faktorer som inte är relaterade till MYH-baserad myofibertyp (PC1) spelar en viktig roll i regleringen av heterogenitet i skelettmuskelfibrer. Överrepresentationsanalys av de främsta drivkrafterna i PC1 visade att variationen i PC1 primärt bestämdes av cell-cell-adhesion och ribosominnehåll i transkriptomet, samt kostamerer och ribosomala proteiner i proteomet (Figur 2B och kompletterande Figurer 6D–E, Kompletterande Dataset 7). I skelettmuskulatur förbinder kostamerer Z-disken med sarkolemma och är involverade i kraftöverföring och signalering. 25 Annoterade PCA-diagram med cell-cell-adhesion (transkriptom, Figur 2C) och kostamer (proteom, Figur 2D) funktioner avslöjade en stark vänsterförskjutning i PC1, vilket indikerar att dessa funktioner är berikade i vissa fibrer.
En mer detaljerad undersökning av myofiberklustring på UMAP-nivå visade att de flesta egenskaperna uppvisade en myofibertypoberoende MYH-baserad uttrycksgradient snarare än myofibersubklusterspecifik. Denna kontinuitet observerades för flera gener associerade med patologiska tillstånd (Figur 2E), såsom CHCHD10 (neuromuskulär sjukdom), SLIT3 (muskelatrofi), CTDNEP1 (muskelsjukdom). Denna kontinuitet observerades också över hela proteomet, inklusive proteiner associerade med neurologiska störningar (UGDH), insulinsignalering (PHIP) och transkription (HIST1H2AB) (Figur 2F). Sammantaget indikerar dessa data kontinuitet i fibertypoberoende långsam/snabba ryckningsheterogenitet över olika myofibrer.
Intressant nog uppvisade drivgener i PC2 god transkriptom-proteom-korrelation (r = 0,663) (Figur 2G), vilket tyder på att långsamma och snabba fibertyper, och i synnerhet de kontraktila och metaboliska egenskaperna hos skelettmuskelfibrer, är transkriptionellt reglerade. Drivgener i PC1 uppvisade dock ingen transkriptom-proteom-korrelation (r = -0,027) (Figur 2H), vilket tyder på att variationer som inte är relaterade till långsamma/snabba fibertyper till stor del regleras posttranskriptionellt. Eftersom variationer i PC1 primärt förklarades av ribosomala genontologiska termer, och med tanke på att ribosomer spelar en avgörande och specialiserad roll i cellen genom att aktivt delta i och påverka proteintranslation,31 började vi härnäst undersöka denna oväntade ribosomala heterogenitet.
Vi färgade först plotten för proteomikens principal component-analys enligt den relativa förekomsten av proteiner i GOCC-termen "cytoplasmatisk ribosom" (Figur 3A). Även om denna term är anrikad på den positiva sidan av PC1, vilket resulterar i en liten gradient, driver ribosomala proteiner partitionering i båda riktningarna av PC1 (Figur 3A). Ribosomala proteiner anrikade på den negativa sidan av PC1 inkluderade RPL18, RPS18 och RPS13 (Figur 3B), medan RPL31, RPL35 och RPL38 (Figur 3C) var de huvudsakliga drivkrafterna på den positiva sidan av PC1. Intressant nog uttrycktes RPL38 och RPS13 i hög grad i skelettmuskulatur jämfört med andra vävnader (Kompletterande Figur 7A). Dessa distinkta ribosomala signaturer i PC1 observerades inte i transkriptomet (Kompletterande Figur 7B), vilket indikerar posttranskriptionell reglering.
A. Principal component analysis (PCA)-diagram färgat enligt cytoplasmatiska ribosomala genontologitermer (GO) över proteomet. Pilar indikerar riktningen för proteinmedierad variation i PCA-diagrammet. Linjelängden motsvarar principal component-poängen för ett givet protein. B, C. PCA-funktionsdiagram för RPS13 och RPL38. D. Oövervakad hierarkisk klusteranalys av cytoplasmatiska ribosomala proteiner. E. Strukturell modell av 80S-ribosomen (PDB: 4V6X) som belyser ribosomala proteiner med olika förekomster i skelettmuskelfibrer. F. Ribosomala proteiner med olika stökiometri lokaliserad nära mRNA-utgångskanalen.
Begreppen ribosomal heterogenitet och specialisering har föreslagits tidigare, varigenom närvaron av distinkta ribosomsubpopulationer (ribosomal heterogenitet) direkt kan påverka proteintranslation i olika vävnader32 och celler33 genom selektiv translation av specifika mRNA-transkriptpooler34 (ribosomspecialisering). För att identifiera subpopulationer av ribosomala proteiner som samuttrycks i skelettmuskelfibrer utförde vi en oövervakad hierarkisk klusteranalys av ribosomala proteiner i proteomet (Figur 3D, kompletterande dataset 8). Som förväntat klustrade inte ribosomala proteiner efter fibertyp baserat på MYH. Vi identifierade dock tre distinkta kluster av ribosomala proteiner; det första klustret (ribosomal_cluster_1) är samreglerat med RPL38 och har därför ökat uttryck i fibrer med en positiv PC1-profil. Det andra klustret (ribosomal_cluster_2) är samreglerat med RPS13 och är förhöjt i fibrer med en negativ PC1-profil. Det tredje klustret (ribosomalt_kluster_3) uppvisar inte koordinerat differentiellt uttryck i skelettmuskelfibrer och kan betraktas som det "kärnliga" ribosomala proteinet i skelettmuskulaturen. Både ribosomalt kluster 1 och 2 innehåller ribosomala proteiner som tidigare har visat sig reglera alternativ translation (t.ex. RPL10A, RPL38, RPS19 och RPS25) och funktionellt påverka utvecklingen (t.ex. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 I överensstämmelse med PCA-resultaten visade den observerade heterogena representationen av dessa ribosomala proteiner över fibrerna också kontinuitet (kompletterande figur 7C).
För att visualisera placeringen av heterogena ribosomala proteiner i ribosomen använde vi en strukturell modell av den humana 80S-ribosomen (Protein Data Bank: 4V6X) (Figur 3E). Efter att ha isolerat ribosomala proteiner som tillhör olika ribosomala kluster var deras placeringar inte nära sammanlänkade, vilket tyder på att vår metod misslyckades med att ge anrikning för vissa regioner/fraktioner av ribosomen. Intressant nog var dock andelen stora subenhetsproteiner i kluster 2 lägre än i kluster 1 och 3 (kompletterande figur 7D). Vi observerade att proteiner med förändrad stökiometri i skelettmuskelfibrer huvudsakligen var lokaliserade till ribosomytan (Figur 3E), vilket överensstämmer med deras förmåga att interagera med interna ribosominträdesplatser (IRES) i olika mRNA-populationer och därigenom koordinera selektiv translation. 40, 41 Dessutom var många proteiner med förändrad stökiometri i skelettmuskelfibrer belägna nära funktionella regioner såsom mRNA-utgångstunneln (Figur 3F), vilka selektivt reglerar translationell förlängning och arrestering av specifika peptider. 42 Sammanfattningsvis tyder våra data på att stökiometrin hos ribosomala proteiner i skelettmuskulaturen uppvisar heterogenitet, vilket resulterar i skillnader mellan skelettmuskelfibrer.
Vi började sedan identifiera signaturer av snabba och långsamma fibrer och utforska mekanismerna bakom deras transkriptionsreglering. Genom att jämföra de kluster av snabba och långsamma fibrer som definieras av UMAP i de två datamängderna (Figur 1G–H och 4A–B), identifierade transkriptomiska och proteomiska analyser 1366 respektive 804 differentiellt förekommande egenskaper (Figur 4A–B, kompletterande datamängder 9–12). Vi observerade de förväntade skillnaderna i signaturer relaterade till sarkomerer (t.ex. tropomyosin och troponin), excitation-kontraktionskoppling (SERCA-isoformer) och energimetabolism (t.ex. ALDOA och CKB). Dessutom uttrycktes transkript och proteiner som reglerar proteinubiquitinering differentiellt i snabba och långsamma fibrer (t.ex. USP54, SH3RF2, USP28 och USP48) (Figur 4A–B). Dessutom var den mikrobiella proteingenen RP11-451G4.2 (DWORF), som tidigare har visat sig uttryckas differentiellt över lammmuskelfibertyper43 och förstärker SERCA-aktivitet i hjärtmuskel44, signifikant uppreglerad i långsamma skelettmuskelfibrer (Figur 4A). På liknande sätt observerades signifikanta skillnader på individuell fibernivå i kända signaturer såsom metabolismrelaterade laktatdehydrogenasisoformer (LDHA och LDHB, Figur 4C och kompletterande Figur 8A)45,46 såväl som tidigare okända fibertypspecifika signaturer (såsom IRX3, USP54, USP28 och DPYSL3) (Figur 4C). Det fanns en signifikant överlappning av differentiellt uttryckta egenskaper mellan de transkriptomiska och proteomiska dataseten (Kompletterande Figur 8B), såväl som en korrelation mellan veckförändringar som huvudsakligen drivs av det mer uttalade differentiella uttrycket av sarkomeregenskaper (Kompletterande Figur 8C). Det är värt att notera att vissa signaturer (t.ex. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) uppvisade stark posttranskriptionell reglering endast på proteomisk nivå och hade långsamma/snabba ryckningsfiberspecifika uttrycksprofiler (kompletterande figur 8C).
A- och B-vulkandiagram som jämför långsamma och snabba kluster identifierade med UMAP-diagrammen (uniform manifold approximation and projection) i figurerna 1G–H. Färgade punkter representerar transkript eller proteiner som är signifikant olika vid FDR < 0,05, och mörkare punkter representerar transkript eller proteiner som är signifikant olika vid logaritmisk förändring > 1. Tvåvägs statistisk analys utfördes med DESeq2 Wald-testet med Benjamini-Hochberg-justerade p-värden (transkriptomik) eller Limma linjär modellmetod med empirisk Bayesiansk analys följt av Benjamini-Hochberg-justering för multipla jämförelser (proteomik). C-signaturdiagram över utvalda differentiellt uttryckta gener eller proteiner mellan långsamma och snabba fibrer. D-anrikningsanalys av signifikant differentiellt uttryckta transkript och proteiner. Överlappande värden är berikade i båda datamängderna, transkriptomvärden är endast berikade i transkriptomet och proteomvärden är endast berikade i proteomet. Statistisk analys utfördes med clusterProfiler-paketet med Benjamini-Hochberg-justerade p-värden. E. Fibertypspecifika transkriptionsfaktorer identifierade av SCENIC baserat på SCENIC-härledda regulatorspecificitetspoäng och differentiellt mRNA-uttryck mellan fibertyper. F. Profilering av utvalda transkriptionsfaktorer som uttrycks differentiellt mellan långsamma och snabba fibrer.
Vi utförde sedan en överrepresentationsanalys av differentiellt representerade gener och proteiner (Figur 4D, Kompletterande Dataset 13). Berikning av signalvägar för egenskaper som skilde sig mellan de två dataseten avslöjade förväntade skillnader, såsom fettsyra-β-oxidation och ketonmetabolismprocesser (långsamma fibrer), myofilament-/muskelkontraktion (snabba respektive långsamma fibrer) och kolhydratkataboliska processer (snabba fibrer). Serin/treoninproteinfosfatasaktivitet var också förhöjd i snabba fibrer, drivet av egenskaper som de regulatoriska och katalytiska fosfatas-subenheterna (PPP3CB, PPP1R3D och PPP1R3A), vilka är kända för att reglera glykogenmetabolismen (47) (Kompletterande Figurer 8D–E). Andra vägar berikade med snabba fibrer inkluderade processande (P-) kroppar (YTHDF3, TRIM21, LSM2) i proteomet (kompletterande figur 8F), potentiellt involverade i posttranskriptionell reglering (48), och transkriptionsfaktoraktivitet (SREBF1, RXRG, RORA) i transkriptomet (kompletterande figur 8G). Långsamma fibrer berikades med oxidoreduktasaktivitet (BDH1, DCXR, TXN2) (kompletterande figur 8H), amidbindning (CPTP, PFDN2, CRYAB) (kompletterande figur 8I), extracellulär matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (kompletterande figur 8J) och receptor-ligandaktivitet (FNDC5, SPX, NENF) (kompletterande figur 8K).
För att få ytterligare insikt i den transkriptionsreglering som ligger till grund för långsamma/snabba muskelfibertyper, utförde vi anrikningsanalys av transkriptionsfaktorer med hjälp av SCENIC49 (kompletterande dataset 14). Många transkriptionsfaktorer var signifikant anrikade mellan snabba och långsamma muskelfibrer (Figur 4E). Detta inkluderade transkriptionsfaktorer som MAFA, vilket tidigare har kopplats till snabb muskelfiberutveckling,50 samt flera transkriptionsfaktorer som inte tidigare associerats med muskelfibertypspecifika genprogram. Bland dessa var PITX1, EGR1 och MYF6 de mest anrikade transkriptionsfaktorerna i snabba muskelfibrer (Figur 4E). Däremot var ZSCAN30 och EPAS1 (även känt som HIF2A) de mest anrikade transkriptionsfaktorerna i långsamma muskelfibrer (Figur 4E). I överensstämmelse med detta uttrycktes MAFA på högre nivåer i UMAP-regionen motsvarande snabba muskelfibrer, medan EPAS1 hade motsatt uttrycksmönster (Figur 4F).
Förutom kända proteinkodande gener finns det ett flertal icke-kodande RNA-biotyper som kan vara involverade i regleringen av mänsklig utveckling och sjukdom. 51, 52 I transkriptomdataset uppvisar flera icke-kodande RNA fibertypspecificitet (Figur 5A och kompletterande dataset 15), inklusive LINC01405, vilket är mycket specifikt för långsamma fibrer och rapporteras vara minskat i muskelmassa från patienter med mitokondriell myopati. 53 Däremot uppvisar RP11-255P5.3, motsvarande lnc-ERCC5-5-genen (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, snabb fibertypspecificitet. Både LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) och RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) uppvisar skelettmuskelspecificitet (kompletterande figurer 9A–B) och har inga kända kontraktila gener inom sitt 1 Mb genomiska område, vilket tyder på att de spelar en specialiserad roll i regleringen av fibertyper snarare än att reglera angränsande kontraktila gener. De långsamma/snabba fibertypspecifika uttrycksprofilerna för LINC01405 respektive RP11-255P5.3 bekräftades med RNAscope (figurer 5B–C).
A. Icke-kodande RNA-transkript regleras signifikant i långsamma och snabba muskelfibrer. B. Representativa RNAscope-bilder som visar specificiteten för långsamma respektive snabba fiberryckningar hos LINC01405 respektive RP11-255P5.3. Skalstreck = 50 μm. C. Kvantifiering av myofibertypspecifikt icke-kodande RNA-uttryck bestämt med RNAscope (n = 3 biopsier från oberoende individer, som jämför snabba och långsamma muskelfibrer inom varje individ). Statistisk analys utfördes med ett tvåsidigt Student's t-test. Boxdiagram visar medianen och den första och tredje kvartilen, med whiskers som pekar på minimi- och maximivärdena. D. De novo arbetsflöde för identifiering av mikrobiella proteiner (skapat med BioRender.com). E. Det mikrobiella proteinet LINC01405_ORF408:17441:17358 uttrycks specifikt i långsamma skelettmuskelfibrer (n = 5 biopsier från oberoende deltagare, som jämför snabba och långsamma muskelfibrer hos varje deltagare). Statistisk analys utfördes med hjälp av Limms linjära modellmetod i kombination med en empirisk Bayesiansk metod, följt av Benjamini-Hochberg-metoden för multipla jämförelser med p-värdesjustering. Boxdiagram visar median-, första och tredje kvartilen, med whiskers som pekar på maximi-/minimivärdena.
Nyligen har studier visat att många förmodade icke-kodande transkript kodar för transkriberade mikrobiella proteiner, av vilka vissa reglerar muskelfunktionen. 44, 55 För att identifiera mikrobiella proteiner med potentiell fibertypspecificitet sökte vi i vår datauppsättning med 1000 fibrer av proteom med hjälp av en anpassad FASTA-fil som innehöll sekvenserna av icke-kodande transkript (n = 305) som hittades i datauppsättningen med 1000 fibrer av transkriptom (Figur 5D). Vi identifierade 197 mikrobiella proteiner från 22 olika transkript, varav 71 reglerades differentiellt mellan långsamma och snabba skelettmuskelfibrer (kompletterande figur 9C och kompletterande dataset 16). För LINC01405 identifierades tre mikrobiella proteinprodukter, varav en uppvisade liknande långsam fiberspecificitet som dess transkript (Figur 5E och kompletterande figur 9D). Således identifierade vi LINC01405 som en gen som kodar för ett mikrobiellt protein specifikt för långsamma skelettmuskelfibrer.
Vi utvecklade ett omfattande arbetsflöde för storskalig proteomisk karakterisering av individuella muskelfibrer och identifierade regulatorer av fiberheterogenitet hos friska tillstånd. Vi tillämpade detta arbetsflöde för att förstå hur nemalinmyopatier påverkar heterogeniteten i skelettmuskelfibrer. Nemalina myopatier är ärftliga muskelsjukdomar som orsakar muskelsvaghet och, hos drabbade barn, uppvisar en rad komplikationer inklusive andnöd, skolios och begränsad rörlighet i extremiteterna.19,20 Vanligtvis, vid nemalinmyopatier, resulterar patogena varianter i gener som aktin alfa 1 (ACTA1) i en övervikt av långsamt ryckande fibermyofibersammansättning, även om denna effekt är heterogen. Ett anmärkningsvärt undantag är troponin T1 nemalinmyopati (TNNT1), som har en övervikt av snabba fibrer. Således kan en bättre förståelse av heterogeniteten bakom den skelettmuskelfiberdysreglering som observeras vid nemalinmyopatier bidra till att reda ut det komplexa sambandet mellan dessa sjukdomar och myofibertyp.
Jämfört med friska kontroller (n=3 per grupp) uppvisade myofibrer isolerade från patienter med nemalinmyopati med mutationer i ACTA1- och TNNT1-generna markant myofiberatrofi eller dystrofi (Figur 6A, kompletterande tabell 3). Detta innebar betydande tekniska utmaningar för proteomisk analys på grund av den begränsade mängden tillgängligt material. Trots detta kunde vi detektera 2485 proteiner i 272 skelettmyofibrer. Efter filtrering för minst 1000 kvantifierade proteiner per fiber, utsattes 250 fibrer för efterföljande bioinformatisk analys. Efter filtrering kvantifierades i genomsnitt 1573 ± 359 proteiner per fiber (Kompletterande figur 10A, kompletterande dataset 17–18). Det är anmärkningsvärt att proteomdjupet i patientprover med nemalinmyopati endast minskade blygsamt, trots den signifikanta minskningen av fiberstorlek. Dessutom gjorde bearbetningen av dessa data med våra egna FASTA-filer (inklusive icke-kodande transkript) det möjligt för oss att identifiera fem mikrobiella proteiner i skelettmyofibrer från patienter med nemalinmyopati (kompletterande dataset 19). Proteomets dynamiska omfång var signifikant bredare, och de totala proteinerna i kontrollgruppen korrelerade väl med resultaten från en tidigare proteomanalys med 1000 fibrer (kompletterande figur 10B–C).
A. Mikroskopiska bilder som visar fiberatrofi eller dystrofi och övervägande av olika fibertyper baserat på MYH i ACTA1- och TNNT1-nemalina myopatier (NM). Skalstreck = 100 μm. För att säkerställa reproducerbarhet av färgning hos ACTA1- och TNNT1-patienter färgades tre patientbiopsier två till tre gånger (fyra snitt per fall) innan representativa bilder valdes. B. Fibertypsproportioner hos deltagare baserat på MYH. C. Principal component analysis (PCA)-diagram av skelettmuskelfibrer hos patienter med nemalina myopatier och kontroller. D. Skelettmuskelfibrer från patienter med nemalina myopatier och kontroller projicerade på ett PCA-diagram bestämt från de 1000 fibrer som analyserats i figur 2. Till exempel vulkandiagram som jämför skillnader mellan deltagare med ACTA1- och TNNT1-nemalina myopatier och kontroller, och mellan deltagare med ACTA1- och TNNT1-nemalina myopatier. Färgade cirklar anger proteiner som var signifikant olika vid π < 0,05, och mörka prickar anger proteiner som var signifikant olika vid FDR < 0,05. Statistisk analys utfördes med hjälp av Limmas linjära modellmetod och empiriska Bayesianska metoder, följt av p-värdejustering för multipla jämförelser med Benjamini-Hochberg-metoden. H. Anrikningsanalys av signifikant differentiellt uttryckta proteiner över hela proteomet och i typ 1- och 2A-fibrer. Statistisk analys utfördes med clusterProfiler-paketet och Benjamini-Hochberg-justerade p-värden. I, J. Principal component analysis (PCA)-diagram färgade med extracellulär matrix och mitokondriell genontologi (GO)-termer.
Eftersom nemalinmyopatier kan påverka andelen MYH-uttryckande myofibertyper i skelettmuskulatur,19,20 undersökte vi först de MYH-uttryckande myofibertyperna hos patienter med nemalinmyopatier och kontroller. Vi bestämde myofibertypen med hjälp av en opartisk metod som tidigare beskrivits för 1000 myofiberanalysen (kompletterande figurer 10D–E) och misslyckades återigen med att identifiera rena 2X myofibrer (figur 6B). Vi observerade en heterogen effekt av nemalinmyopatier på myofibertypen, eftersom två patienter med ACTA1-mutationer hade en ökad andel typ 1-myofibrer, medan två patienter med TNNT1 nemalinmyopati hade en minskad andel typ 1-myofibrer (figur 6B). Faktum är att uttrycket av MYH2 och snabba troponin-isoformer (TNNC2, TNNI2 och TNNT3) minskade vid ACTA1-nemalin myopatier, medan MYH7-uttrycket minskade vid TNNT1-nemalin myopatier (kompletterande figur 11A). Detta överensstämmer med tidigare rapporter om heterogen myofibertypbyte vid nemalin myopatier.19,20 Vi bekräftade dessa resultat med immunhistokemi och fann att patienter med ACTA1-nemalin myopati hade en övervikt av typ 1-myofibrer, medan patienter med TNNT1-nemalin myopati hade det motsatta mönstret (figur 6A).
På nivån av enfiberproteom klustrade skelettmuskelfibrer från patienter med ACTA1- och TNNT1-nemalinmyopati med majoriteten av kontrollfibrerna, där TNNT1-nemalinmyopatifibrer generellt var de mest allvarligt drabbade (Figur 6C). Detta var särskilt tydligt när man plottade PCA-diagram (principal component analysis) av pseudo-uppblåsta fibrer för varje patient, där TNNT1-nemalinmyopatipatienter 2 och 3 verkade vara längst borta från kontrollproverna (kompletterande figur 11B, kompletterande dataset 20). För att bättre förstå hur fibrer från myopatipatienter jämförs med friska fibrer använde vi detaljerad information erhållen från proteomisk analys av 1 000 fibrer från friska vuxna deltagare. Vi projicerade fibrer från myopatidatasetet (ACTA1- och TNNT1-nemalinmyopatipatienter och kontroller) på PCA-diagrammet erhållet från den proteomiska analysen med 1 000 fibrer (Figur 6D). Fördelningen av MYH-fibertyper längs PC2 i kontrollfibrerna liknade den fiberfördelning som erhölls från den proteomiska analysen av 1000 fibrer. Emellertid skiftade de flesta fibrerna hos patienter med nemalin myopati nedåt längs PC2, och överlappade med friska snabba fibrer, oavsett deras nativa MYH-fibertyp. Således, även om patienter med ACTA1 nemalin myopati uppvisade en förskjutning mot typ 1-fibrer när de kvantifierades med MYH-baserade metoder, skiftade både ACTA1 nemalin myopati och TNNT1 nemalin myopati skelettmuskelfiberproteomet mot snabba fibrer.
Vi jämförde sedan direkt varje patientgrupp med friska kontroller och identifierade 256 respektive 552 differentiellt uttryckta proteiner i ACTA1- respektive TNNT1-nemalina myopatier (Figur 6E–G och kompletterande Figur 11C, kompletterande dataset 21). Genanrikningsanalys avslöjade en koordinerad minskning av mitokondriella proteiner (Figur 6H–I, kompletterande dataset 22). Överraskande nog, trots den differentiella dominansen av fibertyper i ACTA1- och TNNT1-nemalina myopatier, var denna minskning helt oberoende av den MYH-baserade fibertypen (Figur 6H och kompletterande Figur 11D–I, kompletterande dataset 23). Tre mikrobiella proteiner reglerades också i ACTA1- eller TNNT1-nemalina myopatier. Två av dessa mikroproteiner, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (även känt som LINC00598 eller Lnc-FOXO1) och ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), visade endast differentiell förekomst i typ 1-myofibrer. ENSG00000215483_TR14_ORF67 har tidigare rapporterats spela en roll i cellcykelreglering.56 Å andra sidan var ENSG00000232046_TR1_ORF437 (motsvarande LINC01798) ökad i både typ 1- och typ 2A-myofibrer i ACTA1-nemalin myopati jämfört med friska kontroller (kompletterande figur 12A, kompletterande dataset 24). Däremot var ribosomala proteiner i stort sett opåverkade av nemalinmyopati, även om RPS17 var nedreglerad i ACTA1 nemalinmyopati (Fig. 6E).
Anrikningsanalys visade också uppreglering av immunsystemprocesser i ACTA1- och TNNT1-nemalinmyopatier, medan celladhesion också ökade i TNNT1-nemalinmyopati (Figur 6H). Anrikningen av dessa extracellulära faktorer återspeglades av att de extracellulära matrixproteinerna förskjutit PCA i PC1 och PC2 i en negativ riktning (dvs. mot de mest drabbade fibrerna) (Figur 6J). Båda patientgrupperna uppvisade ökat uttryck av extracellulära proteiner involverade i immunsvar och sarkolemmala reparationsmekanismer, såsom annexiner (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 och deras interagerande protein S100A1159 (kompletterande figurer 12B–C). Denna process har tidigare rapporterats vara förstärkt vid muskeldystrofier60 men har, såvitt vi vet, inte tidigare associerats med nemalinmyopatier. Normal funktion av denna molekylära maskin krävs för sarkolemmal reparation efter skada och för fusion av nybildade myocyter med myofibrer58,61. Således tyder den ökade aktiviteten i denna process i båda patientgrupperna på ett reparativt svar på skada orsakad av myofiberinstabilitet.
Effekterna av varje nemalinmyopati var väl korrelerade (r = 0,736) och visade rimlig överlappning (kompletterande figurer 11A–B), vilket indikerar att ACTA1 och TNNT1 nemalinmyopati har liknande effekter på proteomet. Vissa proteiner reglerades dock endast i ACTA1- eller TNNT1 nemalinmyopati (kompletterande figurer 11A och C). Det profibrotiska proteinet MFAP4 var ett av de mest uppreglerade proteinerna i TNNT1 nemalinmyopati men förblev oförändrat i ACTA1 nemalinmyopati. SKIC8, en komponent i PAF1C-komplexet som ansvarar för att reglera HOX-gentranskription, nedreglerades i TNNT1 nemalinmyopati men påverkades inte i ACTA1 nemalinmyopati (kompletterande figur 11A). Direkt jämförelse av ACTA1- och TNNT1-nemalinmyopati visade större minskningar av mitokondriella proteiner och ökningar av immunsystemproteiner vid TNNT1-nemalinmyopati (Figur 6G–H och kompletterande Figur 11C och 11H–I). Dessa data överensstämmer med den större atrofi/dystrofi som observerats vid TNNT1-nemalinmyopati jämfört med TNNT1-nemalinmyopati (Figur 6A), vilket tyder på att TNNT1-nemalinmyopati representerar en allvarligare form av sjukdomen.
För att bedöma om de observerade effekterna av nemalinmyopati kvarstår på helmuskelnivå utförde vi en bulkproteomanalys av muskelbiopsier från samma kohort av patienter med TNNT1 nemalinmyopati och jämförde dem med kontroller (n = 3 per grupp) (kompletterande figur 13A, kompletterande dataset 25). Som förväntat var kontrollerna nära besläktade i principalkomponentanalysen, medan patienter med TNNT1 nemalinmyopati uppvisade högre intersamplevariabilitet liknande den som ses i analys av enskilda fibrer (kompletterande figur 13B). Bulkanalysen reproducerade de differentiellt uttryckta proteinerna (kompletterande figur 13C, kompletterande dataset 26) och biologiska processer (kompletterande figur 13D, kompletterande dataset 27) som framhävdes genom att jämföra individuella fibrer, men förlorade förmågan att skilja mellan olika fibertyper och misslyckades med att ta hänsyn till heterogena sjukdomseffekter över fibrerna.
Sammantaget visar dessa data att proteomik med enskilda myofibrer kan belysa kliniska biologiska egenskaper som inte kan detekteras med riktade metoder som immunoblotting. Dessutom belyser dessa data begränsningarna med att enbart använda aktinfibertypning (MYH) för att beskriva fenotypisk anpassning. Även om fibertypbyte skiljer sig mellan aktin- och troponin-nemalinmyopatier, frikopplar båda nemalinmyopatierna MYH-fibertypning från skelettmuskelfibermetabolism mot ett snabbare och mindre oxidativt muskelproteom.
Cellulär heterogenitet är avgörande för att vävnader ska kunna möta deras varierande behov. I skelettmuskulatur beskrivs detta ofta som fibertyper som kännetecknas av olika grader av kraftproduktion och uttröttbarhet. Det är dock tydligt att detta bara förklarar en liten del av skelettmuskelfibervariabiliteten, vilken är mycket mer variabel, komplex och mångfacetterad än man tidigare trott. Tekniska framsteg har nu belyst de faktorer som reglerar skelettmuskelfibrer. Våra data tyder faktiskt på att typ 2X-fibrer kanske inte är en distinkt subtyp av skelettmuskelfibrer. Dessutom identifierade vi metaboliska proteiner, ribosomala proteiner och cellassocierade proteiner som viktiga bestämmande faktorer för heterogenitet i skelettmuskelfibrer. Genom att tillämpa vårt proteomiska arbetsflöde på patientprover med nematodmyopati visade vi vidare att MYH-baserad fibertypning inte helt återspeglar heterogenitet i skelettmuskulaturen, särskilt när systemet störs. Oavsett MYH-baserad fibertyp resulterar nematodmyopati i en förskjutning mot snabbare och mindre oxidativa fibrer.
Skelettmuskelfibrer har klassificerats sedan 1800-talet. Nyligen genomförda omikanalyser har gjort det möjligt för oss att börja förstå uttrycksprofilerna för olika MYH-fibertyper och deras svar på olika stimuli. Som beskrivs här har omikmetoder också fördelen med större känslighet för att kvantifiera fibertypmarkörer än traditionella antikroppsbaserade metoder, utan att förlita sig på kvantifiering av en enda (eller några få) markörer för att definiera en skelettmuskelfibertyp. Vi använde kompletterande transkriptomiska och proteomiska arbetsflöden och integrerade resultaten för att undersöka den transkriptionella och posttranskriptionella regleringen av fiberheterogenitet i mänskliga skelettmuskelfibrer. Detta arbetsflöde resulterade i att vi inte kunde identifiera rena 2X-typfibrer på proteinnivå i vastus lateralis hos vår kohort av friska unga män. Detta överensstämmer med tidigare studier av enskilda fibrer som fann <1 % rena 2X-fibrer i frisk vastus lateralis, även om detta bör bekräftas i andra muskler i framtiden. Skillnaden mellan detektionen av nästan rena 2X-fibrer på mRNA-nivå och endast blandade 2A/2X-fibrer på proteinnivå är förbryllande. MYH-isoformens mRNA-uttryck är inte dygnsrytmiskt,67 vilket tyder på att vi sannolikt inte har "missat" MYH2-startsignalen i till synes rena 2X-fibrer på RNA-nivå. En möjlig förklaring, även om den är rent hypotetisk, kan vara skillnader i protein- och/eller mRNA-stabilitet mellan MYH-isoformer. Faktum är att ingen snabb fiber är 100 % ren för någon MYH-isoform, och det är oklart om MYH1 mRNA-uttrycksnivåer i intervallet 70–90 % skulle resultera i lika mycket MYH1- och MYH2-mängd på proteinnivå. Men när man beaktar hela transkriptomet eller proteomet kan klusteranalys med säkerhet endast identifiera två distinkta kluster som representerar långsamma och snabba skelettmuskelfibrer, oavsett deras exakta MYH-sammansättning. Detta överensstämmer med analyser som använder transkriptomiska metoder med en enda kärna, vilka vanligtvis endast identifierar två distinkta myonukleära kluster. 68, 69, 70 Dessutom, även om tidigare proteomstudier har identifierat typ 2X-fibrer, klustrar dessa fibrer inte separat från resten av de snabba fibrerna och uppvisar endast ett litet antal olika förekommande proteiner jämfört med andra fibertyper baserade på MYH. 14 Dessa resultat tyder på att vi bör återgå till den tidiga 1900-talssynen på klassificering av muskelfibrer, som delade in mänskliga skelettmuskelfibrer inte i tre distinkta klasser baserade på MYH, utan i två kluster baserade på deras metaboliska och kontraktila egenskaper. 63
Ännu viktigare är att myofiberheterogenitet bör beaktas längs flera dimensioner. Tidigare "omics"-studier har pekat i denna riktning och antyder att skelettmuskelfibrer inte bildar diskreta kluster utan är arrangerade längs ett kontinuum.11, 13, 14, 64, 71 Här visar vi att, förutom skillnader i kontraktila och metaboliska egenskaper hos skelettmuskulatur, kan myofibrer differentieras genom egenskaper relaterade till cell-cell-interaktioner och translationsmekanismer. Vi fann faktiskt ribosomheterogenitet i skelettmuskelfibrer som bidrar till heterogenitet oberoende av långsamma och snabba fibertyper. Den bakomliggande orsaken till denna betydande myofiberheterogenitet, oberoende av långsamma och snabba fibertyper, är fortfarande oklar, men den kan peka på specialiserad rumslig organisation inom muskelfasciklar som optimalt svarar på specifika krafter och belastningar,72 specialiserad cellulär eller organspecifik kommunikation med andra celltyper i muskelmikromiljön73,74,75 eller skillnader i ribosomaktivitet inom individuella myofibrer. Ribosomal heteroplasmi, antingen genom paralog substitution av RPL3 och RPL3L eller på nivån av 2'O-metylering av rRNA, har faktiskt visat sig vara associerad med skelettmuskelhypertrofi76,77. Multiomiska och rumsliga tillämpningar i kombination med funktionell karakterisering av individuella myofibrer kommer att ytterligare fördjupa vår förståelse av muskelbiologi på multiomisk nivå78.
Genom att analysera proteomen från enskilda myofibrer från patienter med nemalinmyopatier demonstrerade vi också nyttan, effektiviteten och tillämpbarheten av proteomik med enskilda myofibrer för att belysa den kliniska patofysiologin hos skelettmuskulatur. Genom att jämföra vårt arbetsflöde med global proteomanalys kunde vi dessutom visa att proteomik med enskilda myofibrer ger samma informationsdjup som global vävnadsproteomik och utökar detta djup genom att ta hänsyn till heterogenitet mellan fibrer och myofibertyp. Utöver de förväntade (om än varierande) skillnaderna i fibertypsförhållandet som observerats i ACTA1- och TNNT1-nemalinmyopatier jämfört med friska kontroller,19 observerade vi också oxidativ och extracellulär ombyggnad oberoende av MYH-medierad fibertypsbyte. Fibros har tidigare rapporterats vid TNNT1 nemalinmyopatier.19 Vår analys bygger dock vidare på detta fynd genom att även avslöja ökade nivåer av extracellulära utsöndrade stressrelaterade proteiner, såsom annexiner, involverade i sarkolemmala reparationsmekanismer, i myofibrer från patienter med ACTA1- och TNNT1 nemalinmyopatier.57,58,59 Sammanfattningsvis kan ökade annexinnivåer i myofibrer från patienter med nemalinmyopati representera ett cellulärt svar på att reparera svårt atrofiska myofibrer.
Även om denna studie representerar den största analysen av hela muskelomik på människor hittills, av enskilda fibrer, är den inte utan begränsningar. Vi isolerade skelettmuskelfibrer från ett relativt litet och homogent urval av deltagare och en enda muskel (vastus lateralis). Därför är det omöjligt att utesluta förekomsten av specifika fiberpopulationer över muskeltyper och vid extremer av muskelfysiologi. Vi kan till exempel inte utesluta möjligheten att en delmängd av ultrasnabba fibrer (t.ex. rena 2X-fibrer) uppstår hos högtränade sprinters och/eller styrkeidrottare79 eller under perioder av muskelinaktivitet66,80. Dessutom hindrade den begränsade urvalsstorleken av deltagarna oss från att undersöka könsskillnader i fiberheterogenitet, eftersom fibertypförhållandena är kända för att skilja sig mellan män och kvinnor. Dessutom kunde vi inte utföra transkriptomiska och proteomiska analyser på samma muskelfibrer eller prover från samma deltagare. I takt med att vi och andra fortsätter att optimera analyser av enskilda celler och enskilda myofibrer med hjälp av omics-analys för att uppnå ultralåg provinmatning (som visas här i analysen av fibrer från patienter med mitokondriell myopati), blir möjligheten att kombinera multiomics (och funktionella) metoder inom enskilda muskelfibrer uppenbar.
Sammantaget identifierar och förklarar våra data transkriptionella och posttranskriptionella drivkrafter för heterogenitet i skelettmuskulaturen. Mer specifikt presenterar vi data som utmanar en långvarig dogm inom skelettmuskulaturfysiologi associerad med den klassiska MYH-baserade definitionen av fibertyper. Vi hoppas kunna förnya debatten och i slutändan ompröva vår förståelse av klassificering och heterogenitet i skelettmuskulaturfibrer.
Fjorton kaukasiska deltagare (12 män och 2 kvinnor) gick frivilligt med på att delta i denna studie. Studien godkändes av etikkommittén vid Ghents universitetssjukhus (BC-10237), uppfyllde Helsingforsdeklarationen från 2013 och registrerades på ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Deltagarnas allmänna egenskaper presenteras i tilläggstabell 1. Efter att ha erhållit muntligt och skriftligt informerat samtycke genomgick deltagarna en läkarundersökning innan de slutligen inkluderades i studien. Deltagarna var unga (22–42 år), friska (inga medicinska tillstånd, ingen rökhistoria) och måttligt fysiskt aktiva. Maximal syreupptagning bestämdes med hjälp av en stegergometer för att bedöma fysisk kondition enligt tidigare beskrivning. 81
Muskelbiopsiprover samlades in i vila och fastande tillstånd tre gånger, med 14 dagars mellanrum. Eftersom dessa prover samlades in som en del av en större studie, konsumerade deltagarna placebo (laktos), en H1-receptorantagonist (540 mg fexofenadin) eller en H2-receptorantagonist (40 mg famotidin) 40 minuter före biopsin. Vi har tidigare visat att dessa histaminreceptorantagonister inte påverkar skelettmuskulaturens kondition i vila81, och ingen tillståndsrelaterad klusterbildning observerades i våra kvalitetskontrolldiagram (kompletterande figurer 3 och 6). En standardiserad kost (41,4 kcal/kg kroppsvikt, 5,1 g/kg kroppsvikt kolhydrater, 1,4 g/kg kroppsvikt protein och 1,6 g/kg kroppsvikt fett) upprätthölls i 48 timmar före varje experimentdag, och en standardiserad frukost (1,5 g/kg kroppsvikt kolhydrater) konsumerades på morgonen på experimentdagen. Under lokalbedövning (0,5 ml 1 % lidokain utan adrenalin) togs muskelbiopsier från vastus lateralis-muskeln med hjälp av perkutan Bergström-aspiration.82 Muskelprover bäddades omedelbart in i RNAlater och förvarades vid 4 °C tills manuell fiberdissektion (upp till 3 dagar).
Nyligen isolerade myofiberbuntar överfördes till färskt RNAlater-medium i en odlingsskål. Individuella myofibrer dissekerades sedan manuellt med hjälp av ett stereomikroskop och en fin pincett. Tjugofem fibrer dissekerades från varje biopsi, med särskild uppmärksamhet på att välja fibrer från olika områden av biopsin. Efter dissektion doppades varje fiber försiktigt i 3 μl lysbuffert (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) innehållande proteinas K och DNase-enzymer för att avlägsna oönskade proteiner och DNA. Celllys och protein/DNA-borttagning initierades sedan genom kort virvling, centrifugering av vätskan i en mikrocentrifug och inkubation vid rumstemperatur (10 min). Lysatet inkuberades sedan i en termocykler (T100, Bio-Rad) vid 37 °C i 5 minuter, 75 °C i 5 minuter och förvarades sedan omedelbart vid -80 °C tills vidare bearbetning.
Illumina-kompatibla polyadenylerade RNA-bibliotek framställdes från 2 µl myofiberlysat med hjälp av QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detaljerade metoder finns i tillverkarens manual. Processen börjar med syntes av första strängen av cDNA genom omvänd transkription, under vilken unika molekylära identifierare (UMI) och provspecifika i1-streckkoder introduceras för att säkerställa poolning av prover och minska teknisk variation under nedströmsbearbetning. cDNA från 96 myofibrer poolas sedan och renas med magnetiska pärlor, varefter RNA avlägsnas och andra strängsyntes utförs med hjälp av slumpmässiga primers. Biblioteket renas med magnetiska pärlor, poolspecifika i5/i7-taggar läggs till och PCR-amplifieras. Ett sista reningssteg producerar Illumina-kompatibla bibliotek. Kvaliteten på varje bibliotekspool bedömdes med hjälp av High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Baserat på Qubit-kvantifiering samlades poolerna ytterligare vid ekvimolära koncentrationer (2 nM). Den resulterande poolen sekvenserades sedan på ett NovaSeq 6000-instrument i standardläge med NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotider) med 2 nM laddning (4 % PhiX).
Vår pipeline är baserad på Lexogens QuantSeq Pool-dataanalyspipeline (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data demultiplexerades först med bcl2fastq2 (v2.20.0) baserat på i7/i5-indexet. Läsning 2 demultiplexerades sedan med idemux (v0.1.6) baserat på i1-provstreckkoden och UMI-sekvenser extraherades med umi_tools (v1.0.1). Läsningarna trimmades sedan med cutadapt (v3.4) i flera omgångar för att ta bort korta läsningar (<20 i längd) eller läsningar som enbart bestod av adaptersekvenser. Läsningarna justerades sedan till det mänskliga genomet med hjälp av STAR (v2.6.0c) och BAM-filer indexerades med SAMtools (v1.11). Duplicerade läsningar togs bort med hjälp av umi_tools (v1.0.1). Slutligen utfördes justeringsräkning med hjälp av featureCounts i Subread (v2.0.3). Kvalitetskontroll utfördes med hjälp av FastQC (v0.11.9) i flera mellanliggande steg i processen.
All ytterligare bioinformatisk bearbetning och visualisering utfördes i R (v4.2.3), främst med hjälp av Seurat-arbetsflödet (v4.4.0).83 Därför transformerades individuella UMI-värden och metadatamatriser till Seurat-objekt. Gener uttryckta i mindre än 30 % av alla fibrer togs bort. Prover av låg kvalitet togs bort baserat på ett lägsta tröskelvärde på 1000 UMI-värden och 1000 detekterade gener. Slutligen klarade 925 fibrer alla kvalitetskontrollfiltreringssteg. UMI-värden normaliserades med Seurat SCTransform v2-metoden,84 inklusive alla 7418 detekterade egenskaper, och skillnader mellan deltagarna regresserades bort. Alla relevanta metadata finns i kompletterande dataset 28.
Publiceringstid: 10 sep-2025