Tack för att du besöker Nature.com. Den version av webbläsare du använder har begränsat CSS -stöd. För bästa resultat rekommenderar vi att du använder en nyare version av din webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa pågående stöd, visar vi webbplatsen utan styling eller JavaScript.
Mikrobiell tillväxt i sår manifesterar sig ofta som biofilmer, som stör läkningen och är svåra att utrota. Nya silverförband hävdar att bekämpa sårinfektioner, men deras antibiofilmeffektivitet och infektionsoberoende läkningseffekter är i allmänhet okända. Med hjälp av in vitro- och in vivo-biofilmmodeller av Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa rapporterar vi effektiviteten hos Ag1+ jongenererande förband; AG1+ förband som innehåller etylendiaminetetraättiksyra och bensetoniumklorid (AG1+/EDTA/BC) och förband som innehåller silvernitrat (Ag -oxysalter). , som producerar AG1+, AG2+ och AG3+ joner för att bekämpa sårbiofilm och dess effekt på läkning. AG1+ förband hade minimala effekter på sårbiofilm in vitro och hos möss (C57BL/6J). Däremot minskade syresalter och AG1+/EDTA/BC -förband signifikant antalet livskraftiga bakterier i biofilmer in vitro och visade en signifikant minskning av bakterie- och EPS -komponenter i mussårbiofilmer. Dessa förband hade olika effekter på läkningen av biofilminfekterade och icke-biofilminfekterade sår, med syresatta saltförband med mer gynnsamma effekter på reepitelisering, sårstorlek och inflammation jämfört med kontrollbehandlingar och andra silverförband. De olika fysikalisk-kemiska egenskaperna hos silverförband kan ha olika effekter på sårbiofilm och läkning, och detta bör övervägas när du väljer en förband för behandling av biofilminfekterade sår.
Kroniska sår definieras som "sår som inte går vidare genom de normala läkemedelsstadierna på ett ordnat och snabbt sätt" 1. Kroniska sår skapar en psykologisk, social och ekonomisk börda för patienter och sjukvårdssystemet. Årliga NHS -utgifter för behandling av sår och tillhörande komorbiditeter uppskattas till 8,3 miljarder pund under 2017–182. Kroniska sår är också för närvarande ett pressande problem i USA, där Medicare uppskattar den årliga kostnaden för att behandla patienter med sår till 28,1– 96,8 miljarder dollar.
Infektion är en viktig faktor som förhindrar sårläkning. Infektioner manifesteras ofta som biofilmer, som finns i 78% av kroniska sår. Biofilmer bildas när mikroorganismer blir irreversibelt fästa vid ytor, såsom sårytor, och kan samlas för att bilda extracellulär polymer (EPS) -producerande samhällen. Sårbiofilm är förknippat med ett ökat inflammatoriskt svar som leder till vävnadsskada, vilket kan försena eller förhindra läkning4. Ökningen i vävnadsskada kan delvis bero på ökad aktivitet av matrismetalloproteinaser, kollagenas, elastas och reaktiva syrearter5. Dessutom är inflammatoriska celler och biofilmer själva höga konsumenter av syre och kan därför orsaka lokal vävnadshypoxi, utarma celler i det vitala syre som behövs för effektiv vävnadsreparation6.
Mogna biofilmer är mycket resistenta mot antimikrobiella medel, vilket kräver aggressiva strategier för att kontrollera biofilminfektioner, såsom mekanisk behandling följt av effektiv antimikrobiell behandling. Eftersom biofilmer snabbt kan regenereras kan effektiva antimikrobiella medel minska risken för omformning efter kirurgisk debridement7.
Silver används alltmer i antimikrobiella förband och används ofta som en första linjebehandling för kroniska infekterade sår. Det finns många kommersiellt tillgängliga silverförband, var och en innehåller en annan silverkomposition, koncentration och basmatris. Framstegen i silverarmband har lett till utvecklingen av nya silverarmband. Den metalliska formen av silver (AG0) är inert; För att uppnå antimikrobiell effektivitet måste den förlora en elektron för att bilda joniskt silver (AG1+). Traditionella silverförband innehåller silverföreningar eller metalliskt silver som, när de utsätts för vätska, sönderdelas för att bilda AG1+ -joner. Dessa Ag1+ -joner reagerar med bakteriecellen, avlägsnar elektroner från strukturella komponenter eller kritiska processer som är nödvändiga för överlevnad. Patenterad teknik har lett till utvecklingen av en ny silverförening, Ag -oxysalt (silvernitrat, AG7NO11), som ingår i sårförband. Till skillnad från traditionellt silver producerar nedbrytningen av syreinnehållande salter tillstånd av silver med högre valens (AG1+, AG2+och AG3+). In vitro -studier har visat att låga koncentrationer av syresalter är mer effektiva än enstaka jon silver (AG1+) mot patogena bakterier såsom Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus och Escherichia coli8,9. En annan ny typ av silverförband innehåller ytterligare ingredienser, nämligen etylendiaminetetraättiksyra (EDTA) och bensetoniumklorid (BC), som rapporteras rikta in sig på biofilm EPS och därmed öka penetrationen av silver till biofilmen. Dessa nya silverteknologier erbjuder nya sätt att rikta in sårbiofilmer. Emellertid är effekterna av dessa antimikrobiella medel på sårmiljön och infektionsoberoende läkning viktig för att säkerställa att de inte skapar en ogynnsam sårmiljö eller försenar läkning. Oro för in vitro -silvercytotoxicitet har rapporterats med flera silverförband 10,11. In vitro -cytotoxicitet har emellertid ännu inte översatts till in vivo -toxicitet, och flera AG1+ -förband har visat en bra säkerhetsprofil12.
Här undersökte vi effektiviteten hos karboximetylcellulosaförband innehållande nya silverformuleringar mot sårbiofilm in vitro och in vivo. Dessutom bedömdes effekterna av dessa förband på immunsvar och läkning oberoende av infektion.
Alla användningar som användes var kommersiellt tillgängliga. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, UK) är en icke-antimikrobiell 100% karboximetylcellulosa (CMC) gelfiberförband som användes som kontrollförband i denna studie. Tre antimikrobiella CMC -silverförband utvärderades, nämligen 3M Kerracel AG -klädsel (3M, Knutsford, Storbritannien), som innehåller 1,7 viktprocent. syresalt silversalt (AG7NO11) i högre valens silverjoner (Ag1+, AG2+och AG3+). Under nedbrytningen av AG7NO11 bildas AG1+, Ag2+ och Ag3+ -joner i ett förhållande av 1: 2: 4. Aquacel Ag Extra -förband innehållande 1,2% silverklorid (AG1+) (Convatec, Deeside, UK) 13 och Aquacel AG+Extra klädsel innehållande 1,2% silverklorid (AG1+), EDTA och Benzethoniumklorid (Convatec, Deeside, UK) 14.
Stammarna som användes i denna studie var Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) och Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterier odlades över natten i Muller-Hinton-buljong (Oxoid, Altrincham, Storbritannien). Kulturen över natten späddes sedan 1: 100 i Mueller-Hinton-buljong och 200 | il pläterad på sterila 0,2 um Whatman Cyclopore-membran (Whatman Plc, Maidstone, UK) på Mueller-Hinton Agar Plates (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Great Britain ). ) Kolonial biofilmbildning vid 37 ° C under 24 timmar. Dessa koloniala biofilmer testades för logaritmisk krympning.
Skär förbandet i 3 cm2 fyrkantiga bitar och pre-fisten med sterilt avjoniserat vatten. Placera bandaget över biofilmen i kolonin på agarplattan. Varje 24 ha biofilm avlägsnades och livskraftiga bakterier inom biofilmen (CFU/ml) kvantifierades genom seriell utspädning (10–1 till 10-7) i dagsvinkningsneutraliseringsbuljong (Merck-Millipore). Efter 24 timmars inkubation vid 37 ° C utfördes standardplattantal på Mueller-Hinton-agarplattor. Varje behandling och tidpunkt utfördes i tre exemplar och plattantal upprepades för varje utspädning.
Fläskmageshud erhålls från kvinnliga stora vita grisar inom 15 minuter efter slakt i enlighet med Europeiska unionens exportstandarder. Huden rakades och rengjordes med alkohol våtservetter och frystes sedan vid -80 ° C under 24 timmar för att devitalisera huden. Efter tining tvättades 1 cm2 hudbitar tre gånger med PBS, 0,6% natriumhypoklorit och 70% etanol under 20 minuter varje gång. Innan du tar bort överhuden, ta bort eventuell återstående etanol genom att tvätta 3 gånger i sterila PBS. Huden odlades i en 6-brunnarsplatta med ett 0,45 mikrometer tjockt nylonmembran (Merck-Millipore) på toppen och 3 absorberande kuddar (Merck-Millipore) innehållande 3 ml fetalt bovint serum (Sigma) kompletterat med 10% Dulbeccos modifierade modifierade Örn. Medium (Dulbeccos modifierade Eagle Medium - Aldrich Ltd.).
Koloniala biofilmer odlades såsom beskrivits för exponeringsstudier för biofilm. Efter att ha odlat biofilmen på membranet i 72 timmar applicerades biofilmen på hudytan med användning av en steril ympningsslinga och membranet avlägsnades. Biofilmen inkuberades sedan på grisens dermis under ytterligare 24 timmar vid 37 ° C för att låta biofilmen mogna och hålla fast vid grisens hud. Efter att biofilmen hade mognat och fäst, applicerades en 1,5 cm2-förband, för fuktad med sterilt destillerat vatten, direkt på hudytan och inkuberades vid 37 ° C under 24 timmar. Viabla bakterier visualiserades genom färgning genom att jämnt använda Prestoblue -cellviabilitetsreagens (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) på den apikala ytan för varje explant och inkubera det i 5 minuter. Använd Leica DFC425 digitalkamera för att direkt fånga bilder på Leica MZ8 -mikroskopet. Områden färgade rosa kvantifierades med hjälp av Image Pro Software version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). Skanningselektronmikroskopi utfördes såsom beskrivs nedan.
Bakterier odlade över natten utspäddes 1: 100 i Mueller-Hinton-buljong. 200 μl kultur sattes till steril 0,2 μm Whatman Cyclopore-membran (Whatman, Maidstone, UK) och pläterades på Mueller-Hinton Agar. Biofilmplattor inkuberades vid 37 ° C under 72 timmar för att möjliggöra mogen biofilmbildning.
Efter 3 dagars biofilmmognad placerades ett 3 cm2 kvadratbandage direkt på biofilmen och inkuberades vid 37 ° C under 24 timmar. Efter att ha tagit bort bandaget från biofilmytan tillsattes 1 ml Prestoblue -cellviabilitetsreagens (Invitrogen, Waltham, MA) till ytan på varje biofilm i 20 sekunder. Ytorna torkades innan färgförändringar registrerades med användning av en Nikon D2300 digitalkamera (Nikon UK Ltd., Kingston, Storbritannien).
Förbered kulturer över natten på Mueller-Hinton Agar, överför enskilda kolonier till 10 ml Mueller-Hinton-buljong och inkubera på en skakare vid 37 ° C (100 rpm). Efter inkubation över natten utspäddes kulturen 1: 100 i Mueller-Hinton-buljong och 300 ul upptäcktes på 0,2 um cirkulär Whatman Cyclopore-membran (Whatman International, Maidstone, UK) på Mueller-Hinton Agar och inkuberades vid 37 ° C inom 72 timmar . . Den mogna biofilmen applicerades på såret såsom beskrivs nedan.
Allt arbete med djur genomfördes vid University of Manchester under ett projektlicens som godkänts av Office of Animal Welfare and Ethical Review (P8721BD27) och i enlighet med riktlinjer publicerade av hemmakontoret under 2012 -reviderade ASPA. Alla författare följde ankomstriktlinjerna. Åtta veckor gamla C57BL/6J-möss (Envigo, Oxon, Storbritannien) användes för alla in vivo-studier. Möss bedövades med isofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Storbritannien) och deras dorsala ytor rakades och rengavs. Varje mus fick sedan ett 2 × 6 mm excisionssår med användning av en stiefelbiopsipunch (Schuco International, Hertfordshire, Storbritannien). För biofilminfekterade sår, applicera 72-timmars kolonial biofilm som odlas på membranet såsom beskrivits ovan till sårets dermala skikt med användning av en steril ympningsslinga omedelbart efter skada och kassera membranet. En kvadratcentimeter klädsel är förmärkt med sterilt vatten för att upprätthålla en fuktig sårmiljö. Redningar applicerades direkt på varje sår och täcktes med 3M Tegaderm -film (3M, Bracknell, Storbritannien) och Mastisol Liquid Lime (Ealoquest Healthcare, Ferndale, MI) applicerade runt kanterna för att ge ytterligare vidhäftning. Buprenorphine (AnimalCare, York, UK) administrerades i en koncentration av 0,1 mg/kg som smärtstillande medel. Kullmöss tre dagar efter skada med hjälp av schema 1 -metoden och ta bort, halvera och lagra sårområdet efter behov.
Hematoxylin (Thermofisher Scientific) och Eosin (Thermofisher Scientific) färgning utfördes enligt tillverkarens protokoll. Sårområde och reepitelisering kvantifierades med hjälp av Image Pro Software version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Vävnadssektioner dewaxades i xylen (Thermofisher Scientific, Loughborough, Storbritannien), rehydratiserades med 100–50% graderad etanol och nedsänktes kort i avjoniserat vatten (Thermofisher Scientific). Immunohistokemi utfördes med användning av Vectastain Elite ABC PK-6104-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) enligt tillverkarens protokoll. Primära antikroppar mot neutrofiler NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) och makrofager MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Storbritannien) utspäddes 1: 100 i blockerande lösning och läggs till den skurna ytan, följt av 2 antikroppar Anti-, Vectastainain ABC och Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substratpaket (Vector Laboratories, Burlingame, CA) och motfärgade med hematoxylin. Bilder förvärvades med hjälp av ett Olympus BX43-mikroskop och ett Olympus DP73 digitalkamera (Olympus, Southend-on-Sea, UK).
Hudprover fixerades i 2,5% glutaraldehyd och 4% formaldehyd i 0,1 M HEPES (pH 7,4) under 24 timmar vid 4 ° C. Prover dehydratiserades med användning av graderad etanol och torkades i CO2 med användning av en Quorum K850 kritisk punkttork (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) och sputter belagd med guldpalladlegering med användning av en Quorum SC7620 Mini Sputterer/Glow-urladdningssystem. Prover avbildades med användning av ett FEI -kvanta 250 skanningselektronmikroskop (Thermofisher Scientific) för att visualisera sårets centrala punkt.
TOTO-1 jodid (2 μM) applicerades på den skurna mussårytan och inkuberades under 5 minuter vid 37 ° C (Thermofisher Scientific) och behandlades med SYTO-60 (10 μM) vid 37 ° C (Thermofisher Scientific). 15-minuters z-stackbilder skapades med hjälp av en Leica TCS SP8.
Biologiska och tekniska replikatdata tabellerades och analyserades med hjälp av GraphPad Prism V9 -programvara (GraphPad -programvara, La Jolla, CA). Envägsanalys av varians med flera jämförelser med användning av Dunnetts post hoc-test användes för att testa för skillnader mellan varje behandling och den icke-antimikrobiella kontrollförbandet. Ett P -värde <0,05 ansågs vara signifikant.
Effektiviteten av silvergel -fibrösa förband utvärderades först mot biofilmkolonier av Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa in vitro. Silverförband innehåller olika formler av silver: traditionella silverförband producerar AG1+ -joner; Silverförband, som kan producera AG1+ -joner efter tillsats av EDTA/BC, kan förstöra biofilmmatrisen och utsätta bakterier för silver under antibakteriell effekt av silver. joner15 och förband som innehåller syresalter som producerar Ag1+, Ag2+ och Ag3+ -joner. Dess effektivitet jämfördes med en icke-antimikrobiell kontrollförband gjord av gelade fibrer. Återstående livskraftiga bakterier inom biofilmen bedömdes var 24: e timme under 8 dagar (figur 1). På dag 5 återkallades biofilmen med 3,85 × 105. Staphylococcus aureus eller 1,22 × 105p. aeruginosa för att bedöma återhämtning av biofilm. Jämfört med icke-antimikrobiella kontrollförband hade AG1+ -förband minimal effekt på bakteriell livskraft i Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa biofilmer under 5 dagar. Däremot var förband innehållande syresatta Ag och Ag1 + + EDTA/BC -salter effektiva för att döda bakterier inom biofilmen inom 5 dagar. Efter upprepad ympning med planktoniska bakterier på dag 5 observerades ingen återställande av biofilmen (fig. 1).
Kvantifiering av livskraftiga bakterier i Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa biofilmer efter behandling med silverförband. Biofilmkolonier av Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa behandlades med silverförband eller icke-antimikrobiella kontrollförband, och antalet livskraftiga bakterier som återstod bestämdes var 24: e timme. Efter 5 dagar återkallades biofilmen med 3,85 × 105. Staphylococcus aureus eller 1,22 × 105p. Kolonier av bakterioplankton Pseudomonas aeruginosa bildades individuellt för att bedöma biofilmåtervinning. Grafer visar medelvärde +/- Standardfel.
För att visualisera effekten av silverförband på biofilmens livskraft applicerades förband på mogna biofilmer som odlats på svinhud ex vivo. Efter 24 timmar avlägsnas förbandet och biofilmen färgas med ett blått reaktivt färgämne, som metaboliseras av levande bakterier till en rosa färg. Biofilmer som behandlades med kontrollförband var rosa, vilket indikerar närvaron av livskraftiga bakterier i biofilmen (figur 2A). Däremot var biofilmen som behandlades med Ag -oxysolförbandet främst blå, vilket indikerade att de återstående bakterierna på ytan av grisens hud var icke -genomförbara bakterier (figur 2B). Blandad blå och rosa färg observerades i biofilmer behandlade med AG1+ -innehållande förband, vilket indikerar närvaron av livskraftiga och icke-livskraftiga bakterier i biofilmen (figur 2C), medan EDTA/BC-förband innehållande AG1+ var övervägande blå med några rosa fläckar. indikerar områden som inte påverkas av silverförbandet (figur 2D). Kvantifiering av aktiva (rosa) och inaktiva (blå) områden visade att kontrolllappen var 75% aktiv (figur 2E). AG1 + + EDTA/BC -förband utförde på samma sätt som syresalt saltförband, med överlevnadsgraden på 13% respektive 14%. AG1+ -förbandet minskade också bakteriell livskraft med 21%. Dessa biofilmer observerades sedan med användning av skanningselektronmikroskopi (SEM). Efter behandling med kontrollförbandet och AG1+ -förbandet observerades ett skikt av Pseudomonas aeruginosa som täckte svinhuden (figur 2F, H), medan efter behandling med AG1+ -förbandet hittades få bakterieceller och få bakterieceller hittades under. Kollagenfibrer kan betraktas som vävnadsstrukturen i svinhud (figur 2G). Efter behandling med AG1 + + EDTA/BC -förband var bakteriella plack och underliggande kollagenfiberplack synliga (figur 2i).
Visualisering av Pseudomonas aeruginosa biofilm efter behandling av silverförband. . Levande bakterier är rosa, icke-livliga bakterier och grishud är blå. (E) Kvantifiering av Pseudomonas aeruginosa-biofilmer som odlas på svinhud (rosa fläck) med användning av skanningselektronmikroskopi Bild Pro version 10 (FI) och behandlas med en silverförband eller en icke-antimikrobiell kontrollförband i 24 timmar. SEM -skala stång = 5 um. (J - M) Kolonialbiofilmer växte på filter och färgades med prestoblue reaktivt färgämne efter 24 timmars inkubation med silverförband.
För att bestämma om nära kontakt mellan förbandarna och biofilmerna påverkade effektiviteten hos förband, behandlades kolonialbiofilmer som placerades på en plan yta med förband i 24 timmar och färgades sedan med reaktiva färgämnen. Den obehandlade biofilmen var mörkrosa i färg (figur 2J). I motsats till biofilmer behandlade med förband innehållande syresalter (figur 2K) visade biofilmer behandlade med förband innehållande Ag1+ eller Ag1++ EDTA/BC band med rosa färgning (figur 2L, M). Denna rosa färgning indikerar närvaron av livskraftiga bakterier och är associerad med suturområdet i förbandet. Dessa inspelade områden skapar döda utrymmen som gör att bakterier i biofilmen kan överleva.
För att utvärdera effektiviteten hos silverförband in vivo behandlades utskurna sår av möss av möss med mogna S. aureus och P. aeruginosa biofilmer med icke-antimikrobiella kontrollförband eller silverförband. Efter 3 dagars behandling visade makroskopisk bildanalys mindre sårstorlekar när de behandlades med syresatta saltförband jämfört med icke-antimikrobiella kontrollförband och andra silverförband (figur 3A-H). För att bekräfta dessa observationer skördades sår och sårområde och reepitelisering kvantifierades på hematoxylin och eosinfärgade vävnadssektioner med användning av Image Pro Software version 10 (figur 3i-L).
Effekten av silverförband på sårytan och återepitelisering av sår infekterade med biofilmer. (A - H) Små celler infekterade med biofilmer av Pseudomonas aeruginosa (A - D) och Staphylococcus aureus (E - H) efter tre dagars behandling med en icke -antimikrobiell kontrollförband, en syresalt Saltförband, en AG1+ -förband och en AG1++ dressing. Representativa makroskopiska bilder. Sår av möss med AG1 + + EDTA/BC -förband. (IL) Representant Pseudomonas aeruginosa -infektion, histologiska sektioner färgade med hematoxylin och eosin, som används för att kvantifiera sårområdet och epitelregenerering. Kvantifiering av sårområdet (M, O) och procentuell reepitelisering (n, p) av sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa (M, N) och Staphylococcus aureus (O, P) biofilmer (per behandlingsgrupp n = 12). Grafer visar medelvärde +/- Standardfel. * betyder p = <0,05 ** betyder p = <0,01; Makroskopisk skala = 2,5 mm, histologisk skala = 500 um.
Kvantifiering av sårområdet i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa-biofilm (figur 3M) visade att sår som behandlades med Ag-oxysalter hade en genomsnittlig sårstorlek på 2,5 mm2, medan den icke-antimikrobiella kontrollförbandet hade en genomsnittlig sårstorlek på 3,1 mm2, vilket inte är inte sann. nådde statistisk betydelse (figur 3M). p = 0,423). Sår behandlade med AG1+ eller AG1++ EDTA/BC visade ingen minskning av sårområdet (3,1 mm2 respektive 3,6 mm2). Behandling med syresalt saltförband främjade reepitelisering i större utsträckning än den icke-antimikrobiella kontrollförbandet (34% respektive 15%; P = 0,029) respektive AG1+ eller AG1++ EDTA/BC (10% respektive 11%) ( Figur 3N). . respektive).
Liknande trender i sårområdet och epitelregenerering observerades i sår infekterade med S. aureus biofilmer (figur 3O). Förband innehållande syresalter silversalter minskade sårområdet (2,0 mm2) med 23% jämfört med den icke-antimikrobiella förbandet (2,6 mm2), även om denna reduktion inte var signifikant (p = 0,304) (fig. 3O). Dessutom reducerades sårområdet i AG1+ -behandlingsgruppen något (2,4 mm2), medan såret som behandlades med AG1++ EDTA/BC -förband inte minskade sårområdet (2,9 mm2). Syresalter av Ag främjade också omepitelisering av sår infekterade med S. aureus biofilm (31%) i större utsträckning än de som behandlades med icke-antimikrobiella kontrollförband (12%, p = 0,003) (figur 3P). AG1+ -förband (16%, p = 0,903) och Ag+ 1+ EDTA/BC -förband (14%, p = 0,965) visade nivåer av epitelregenerering som liknar kontrollen.
För att visualisera effekten av silverförband på biofilmmatrisen utfördes TOTO 1 och SYTO 60 jodidfärgning (fig. 4). TOTO 1 jodid är ett cellimpermeabelt färgämne som kan användas för att exakt visualisera extracellulära nukleinsyror, som finns rikligt i EPS för biofilmer. SYTO 60 är ett cellpermeabelt färgämne som används som en försämring16. Observationer av TOTO 1 och SYTO 60 jodid i sår inokulerade med biofilmer av Pseudomonas aeruginosa (figur 4A-D) och Staphylococcus aureus (figur 4i-L) visade att EPS efter 3 dagars klädsel, EPS i biofilmen minskade signifikant. Innehåller syresalter AG och AG1 + + EDTA/BC. AG1+ -förband utan ytterligare antibiofilmkomponenter reducerade signifikant cellfritt DNA i sår ympade med Pseudomonas aeruginosa men var mindre effektiva i sår ympade med Staphylococcus aureus.
In vivo -avbildning av sårbiofilm efter 3 dagars behandling med kontroll eller silverförband. Konfokala bilder av Pseudomonas aeruginosa (A - D) och Staphylococcus aureus (I - L) färgade med toto 1 (grön) för att visualisera extracellulära nukleinsyror, en del av extracellulära biofilmpolymerer. För att färga intracellulära nukleinsyror använder du SYTO 60 (röd). syror. P. Skanning av elektronmikroskopi av sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa (E - H) och Staphylococcus aureus (M - P) biofilmer efter 3 dagars behandling med kontroll och silverförband. SEM -skala stång = 5 um. Konfokal avbildningsskala stång = 50 um.
Skanningselektronmikroskopi visade att möss ympade med biofilmkolonier av Pseudomonas aeruginosa (figur 4E-H) och Staphylococcus aureus (figur 4M-P) hade signifikant färre bakterier i sina sår efter 3 dagars behandling med alla silverförband.
För att utvärdera effekten av silverförband på sårinflammation hos biofilminfekterade möss, var sektioner av biofilminfekterade sår behandlade med kontroll eller silverförband under 3 dagar immunohistokemiskt med antikroppar specifika för neutrofiler och makrofager. Kvantitativ bestämning av neutrofiler och makrofager internt. granuleringsvävnad. Figur 5). Alla silverförband minskade antalet neutrofiler och makrofager i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa jämfört med icke-antimikrobiella kontrollförband efter tre dagars behandling. Emellertid resulterade behandling med den syresatta silversaltförbandet i en större minskning av neutrofiler (p = <0,0001) och makrofager (p = <0,0001) jämfört med andra testade silverförband (figur 5i, j). Även om AG1++ EDTA/BC hade en större effekt på sårbiofilm, minskade den neutrofil- och makrofagnivåer i mindre utsträckning än AG1+ -förbandet. Måttliga sår infekterade med S. aureus biofilm observerades också efter klädsel med Ag (p = <0,0001), AG1+ (p = 0,0008) och Ag1 ++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisoler jämfört med kontroll. Liknande trender observeras för neutropeni. Bandage (fig. 5K). Emellertid visade endast den syresatta Ag -saltförbandet en signifikant minskning av antalet makrofager i granuleringsvävnad jämfört med kontroll i sår infekterade med S. aureus -biofilmer (p = 0,0339) (figur 5L).
Neutrofiler och makrofager kvantifierades i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus biofilmer efter 3 dagars behandling med icke-antimikrobiell kontroll eller silverförband. Neutrofiler (AD) och makrofager (EH) kvantifierades i vävnadssektioner färgade med antikroppar specifika för neutrofiler eller makrofager. Kvantifiering av neutrofiler (I och K) och makrofager (J och L) i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa (I och J) och Staphylococcus aureus (K&L) biofilmer. N = 12 per grupp. Grafer visar medelvärde +/- Standardfel, betydelsevärden jämfört med icke-antibakteriell kontrollförband, * betyder p = <0,05, ** betyder p = <0,01; *** betyder p = <0,001; indikerar p = <0,0001).
Vi bedömde sedan effekten av silverförband på infektionsoberoende läkning. Icke-infekterade excisionssår behandlades med en icke-antimikrobiell kontrollförband eller en silverförband under 3 dagar (figur 6). Bland de testade silverförlänningarna verkade endast sår behandlade med det syresatta saltförbandet mindre på makroskopiska bilder än sår som behandlades med kontrollen (figur 6A-D). Kvantifiering av sårområdet med hjälp av histologisk analys visade att det genomsnittliga sårområdet efter behandling med Ag -oxysolförbandet var 2,35 mm2 jämfört med 2,96 mm2 för sår som behandlades med kontrollgruppen, men denna skillnad nådde inte statistisk betydelse (p = 0,488) (fig . Däremot observerades ingen minskning av sårområdet efter behandling med AG1+ (3,38 mm2, p = 0,757) eller AG1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) förband jämfört med kontrollgruppen. Ökad epitelregenerering observerades med Ag -oxysolförband jämfört med kontrollgruppen (30% mot 22%, respektive), även om detta inte nådde betydelse (p = 0,067), detta är ganska betydande och bekräftar tidigare resultat. En förband med oxysoler främjar reepitelisering. -Epitelisering av oinfekterade sår17. Däremot hade behandling med AG1+ eller AG1++ EDTA/BC-förband ingen effekt eller visade minskad reepitelisering jämfört med kontroll.
Effekt av silver sårförband på sårläkning hos oinfekterade möss med fullständig resektion. (AD) Representativa makroskopiska bilder av sår efter tre dagars behandling med en icke-antimikrobiell kontrollförband och en silverförband. (EH) Representativa sårsektioner färgade med hematoxylin och eosin. Kvantifiering av sårområdet (I) och procentandel av reepitelisering (J) beräknades utifrån histologiska sektioner vid sårets mittpunkt med användning av bildanalysprogramvara (n = 11–12 per behandlingsgrupp). Grafer visar medelvärde +/- Standardfel. * betyder p = <0,05.
Silver har en lång historia av användning som en antimikrobiell terapi vid sårläkning, men de många olika formuleringarna och leveransmetoderna kan leda till skillnader i antimikrobiell effekt 18. Dessutom förstås antibiofilmegenskaperna hos specifika silverleveranssystem inte helt. Även om värdens immunsvar är relativt effektivt mot planktoniska bakterier, är den i allmänhet mindre effektiv mot biofilmer19. Planktoniska bakterier fagocytoseras lätt av makrofager, men inom biofilmer utgör aggregerade celler ytterligare problem genom att begränsa värdsvaret i den utsträckning som immunceller kan genomgå apoptos och frisätta proinflammatoriska faktorer för att förbättra immunsvaret20. Det har observerats att vissa leukocyter kan penetrera biofilmer21 men inte kan fagocytosbakterier när detta försvar är komprometterat22. Ett holistiskt tillvägagångssätt bör användas för att stödja värdens immunsvar mot sårbiofilminfektion. Sår debridement kan fysiskt störa biofilmen och ta bort det mesta av bioBurden, men värdens immunsvar kan vara ineffektivt mot att återstående biofilm, särskilt om värdimmunsvaret äventyras. Således kan antimikrobiella terapier såsom silverförband stödja värdens immunsvar och eliminera biofilminfektioner. Komposition, koncentration, löslighet och leveranssubstrat kan påverka den antimikrobiella effektiviteten hos silver. Under de senaste åren har framstegen inom silverbearbetningsteknologi gjort dessa förband mer effektiva9,23. När silverförbandstekniken går framåt är det viktigt att förstå effektiviteten hos dessa förband vid kontroll av sårinfektion och, ännu viktigare, effekterna av dessa potenta former av silver på sårmiljön och läkning.
I denna studie jämförde vi effektiviteten hos två avancerade silverförband med konventionella silverförband som producerar AG1+ -joner mot biofilmer med olika in vitro- och in vivo -modeller. Vi bedömde också effekten av dessa förband på sårmiljön och infektionsoberoende läkning. För att minimera påverkan av leveransmatrisen bestod alla testade silverförband av karboximetylcellulosa.
Vår preliminära utvärdering av dessa silverförband mot kolonialbiofilmer av Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus visar att, till skillnad från traditionella AG1+ -förband, två avancerade silverförband, AG1++ EDTA/BC och syresalter är effektiva vid 5. Effektivt dödande biofilbbåt Bacteria i inuti är inuti inuti inom sig inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är inuti är in inom infilmbakteria i inuti är inuti är inuti är inuti bakterien några dagar. Dessutom förhindrar dessa förbandsbildningar av biofilm vid upprepad exponering för planktoniska bakterier. AG1+ -förbandet innehöll silverklorid, samma silverförening och basmatris som AG1++ EDTA/BC, och hade en begränsad effekt på bakteriell livskraft inom biofilmen under samma period. Observationen att en AG1++ EDTA/BC -förband var mer effektiv mot biofilm än en AG1+ -förband som består av samma matris och en silverförening stöder uppfattningen att ytterligare ingredienser krävs för att öka effektiviteten av silverklorid mot biofilm, vilket har rapporterats har rapporterats någon annanstans15. Dessa resultat stöder idén att BC och EDTA spelar en ytterligare roll som bidrar till den totala effektiviteten för klädsel och att frånvaron av denna komponent i AG1+ -förband kan ha bidragit till misslyckandet med att demonstrera in vitro -effekt. Vi fann att syresalt Saltförband som producerade AG2+ och AG3+ -joner uppvisade starkare antibakteriell effektivitet än Ag1+ och vid nivåer som liknar AG1++ EDTA/BC. På grund av den höga redoxpotentialen är det emellertid oklart hur länge Ag3+ -joner förblir aktiva och effektiva mot sårbiofilmer och därför förtjänar ytterligare studier. Dessutom finns det många olika förband som genererar AG1+ -joner som inte testades i denna studie. Dessa förband består av olika silverföreningar, koncentrationer och basmatriser, vilket kan påverka tillförseln av AG1+ -joner och deras effektivitet mot biofilmer. Det är också värt att notera att det finns många olika in vitro- och in vivo -modeller som används för att utvärdera effektiviteten av sårförband mot biofilmer. Den typ av modell som används, liksom salt- och proteininnehållet i media som används i dessa modeller, kommer att påverka förbandets effektivitet. I vår in vivo -modell tillät vi biofilmen att mogna in vitro och överförde den sedan till sårets dermala yta. Värdmusens immunsvar är relativt effektivt mot planktoniska bakterier som appliceras på såret och därmed bildar en biofilm när såret läker. Tillsatsen av mogen biofilm till ett sår begränsar effektiviteten hos värdens immunsvar mot biofilmbildning genom att låta den mogna biofilmen etablera sig inom såret innan läkning kan börja. Således tillåter vår modell oss att utvärdera effektiviteten hos antimikrobiella förband på mogna biofilmer innan sår börjar läka.
Vi fann också att klädningspass påverkade effektiviteten hos silverförband på in vitro-odlade biofilmer och svinhud. Nära kontakt med såret anses vara kritiskt för den antimikrobiella effektiviteten hos förbandet24,25. Förband innehållande syresalter var i nära kontakt med mogna biofilmer, vilket resulterade i en betydande minskning av antalet livskraftiga bakterier inom biofilmen efter 24 timmar. Däremot, när de behandlades med AG1+ och AG1++ EDTA/BC -förband, återstod ett betydande antal livskraftiga bakterier. Dessa förband innehåller suturer längs hela förbandet, vilket skapar döda utrymmen som förhindrar nära kontakt med biofilmen. I våra in vitro-studier förhindrade dessa icke-kontaktområden dödandet av livskraftiga bakterier inom biofilmen. Vi bedömde bakteriell livskraft först efter 24 timmars behandling; Med tiden, när förbandet blir mer mättat, kan det finnas mindre dött utrymme, vilket minskar området för dessa livskraftiga bakterier. Detta belyser emellertid vikten av sammansättningen av förbandet, inte bara typen av silver i förbandet.
Även om in vitro -studier är användbara för att jämföra effektiviteten hos olika silverteknologier, är det också viktigt att förstå effekterna av dessa förband på biofilmer in vivo, där värdvävnad och immunsvar bidrar till effektiviteten av förband mot biofilmer. Effekten av dessa förband på sårbiofilmer observerades med användning av skanningselektronmikroskopi och EPS -färgning av biofilmen med användning av intracellulärt och extracellulära DNA -färgämnen. Vi fann att efter 3 dagars behandling var alla förbandarna effektiva för att minska cellfria DNA i biofilminfekterade sår, men AG1+ -förbandet var mindre effektivt i Staphylococcus aureus-infekterade sår. Skanningselektronmikroskopi visade också att signifikant mindre bakterier var närvarande i sår behandlade med silverförband, även om detta var mer uttalat med den syresatta Ag -saltförbandet och AG1++ EDTA/BC -förbandet jämfört med AG1+ -förbandet. Dessa data visar att de testade silverförband hade varierande grad av påverkan på biofilmstrukturen, men ingen av silverförband kunde utrota biofilmen, vilket stödde behovet av en helhetssyn på behandlingen av sårbiofilminfektioner; Användning av silverarmband. Behandlingen föregås av fysisk debridement för att avlägsna det mesta av biofilmen.
Kroniska sår är ofta i ett tillstånd av svår inflammation, med överskott av inflammatoriska celler kvar i sårvävnaden under en längre tid, orsakar vävnadsskada och tappar syre som behövs för effektiv cellulär metabolism och funktion i såret26. Biofilmer förvärrar denna fientliga sårmiljö genom att påverka läkning på olika sätt, inklusive hämning av cellproliferation och migration och aktivering av proinflammatoriska cytokiner27. När silverförband blir mer effektiva är det viktigt att förstå vilken inverkan de har på sårmiljön och läkning.
Intressant nog, även om alla silverförband påverkade biofilmkompositionen, ökade endast syresalt saltförband med silver salt i dessa infekterade sår. Dessa data stöder våra tidigare resultat17 och de från Kalan et al. (2017) 28, som visade goda säkerhets- och toxicitetsprofiler av syresalter, eftersom lägre koncentrationer av silver var effektiva mot biofilmer.
Vår nuvarande studie belyser skillnaderna i silverteknologi mellan antimikrobiella silverförband och påverkan av denna teknik på sårmiljön och infektionsoberoende läkning. Dessa resultat skiljer sig emellertid från tidigare studier som visar att AG1 + + EDTA/BC -klädsel förbättrade läkningsparametrarna för skadade kaninöron in vivo. Detta kan emellertid bero på skillnader i djurmodeller, mättider och bakterieapplikationsmetoder29. I detta fall gjordes sårmätningar 12 dagar efter skada för att tillåta de aktiva ingredienserna i förbandet att verka på biofilmen under en längre tid. Detta stöds av en studie som visade att kliniskt infekterade bensår behandlade med AG1 + + EDTA/BC ökade initialt i storlek efter en veckas behandling, och sedan under de kommande tre veckorna av behandlingen med AG1 + + EDTA/BC och inom 4 veckor efter det Användning av icke-antimikrobiella medel. narkotika. CMC -förband för att minska storleken på sår30.
Vissa former och koncentrationer av silver har tidigare visat sig vara cytotoxiska in vitro 11, men dessa in vitro -resultat översätter inte alltid till negativa effekter in vivo. Dessutom har framsteg inom silverteknologi och en bättre förståelse av silverföreningar och koncentrationer i förband lett till utvecklingen av många säkra och effektiva silverförband. Men när silverförklädtekniken går framåt är det viktigt att förstå effekterna av dessa förband på sårmiljön31,32,33. Det rapporterades tidigare att den ökade hastigheten för reepitelisering motsvarar en ökad andel antiinflammatoriska M2-makrofager jämfört med den pro-inflammatoriska M1-fenotypen. Detta noterades i en tidigare musmodell där silverhydrogel sårförband jämfördes med silver sulfadiazin och icke-antimikrobiella hydrogeler34.
Kroniska sår kan uppvisa överdriven inflammation och det har observerats att närvaron av överskott av neutrofiler kan vara skadligt för sårläkning35. I en studie i neutrofil-utarmade möss försenade närvaron av neutrofiler reepitelisering. Närvaron av överskott av neutrofiler leder till höga nivåer av proteaser och reaktiva syrearter, såsom superoxid och väteperoxid, som är förknippade med kroniska och långsamma sår37,38. På samma sätt kan en ökning av makrofagantal, om det är okontrollerat, leda till försenad sårläkning39. Denna ökning är särskilt viktig om makrofager inte kan övergå från en pro-inflammatorisk fenotyp till en pro-realing fenotyp, vilket resulterar i att sår som inte lämnar den inflammatoriska fasen av läkning40. Vi observerade en minskning av neutrofiler och makrofager i biofilminfekterade sår efter 3 dagars behandling med alla silverförband, men minskningen var mer uttalad med syresatta saltförband. Denna minskning kan vara ett direkt resultat av immunsvaret på silver, ett svar på minskade bioburen eller såret i ett senare skede av läkning och därför immunceller i såret minskas. Att minska antalet inflammatoriska celler i såret kan upprätthålla en miljö som bidrar till sårläkning. Verkningsmekanismen för hur AG-oxysalt främjar infektionsoberoende läkning är oklar, men förmågan hos Ag-oxysalt att producera syre och förstöra skadliga nivåer av väteperoxid, en mediator för inflammation, kan förklara detta och kräver ytterligare studie17.
Kroniska infekterade sår som inte är hemliga utgör ett problem för både läkare och patienter. Även om många förband hävdar antimikrobiell effektivitet, fokuserar forskning sällan på andra viktiga faktorer som påverkar sårmikro -miljön. Denna studie visar att olika silverteknologier har olika antimikrobiella effektivitet och, viktigast, olika effekter på sårmiljön och läkning, oberoende av infektion. Även om dessa in vitro- och in vivo -studier visar effektiviteten hos dessa förband vid behandling av sårinfektioner och främjar läkning, behövs randomiserade kontrollerade studier för att utvärdera effektiviteten hos dessa förband i kliniken.
De datasätt som användes och/eller analyserades under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.
Posttid: jul-15-2024