Tack för att du besöker Nature.com. Den webbläsarversion du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa resultat rekommenderar vi att du använder en nyare version av din webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt support, visar vi webbplatsen utan styling eller JavaScript.
Mikrobiell tillväxt i sår manifesterar sig ofta som biofilmer, vilka stör läkningen och är svåra att utrota. Nya silverförband påstås bekämpa sårinfektioner, men deras antibiofilmeffektivitet och infektionsoberoende läkningseffekter är i allmänhet okända. Med hjälp av in vitro- och in vivo-biofilmmodeller av Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa rapporterar vi effektiviteten hos Ag1+-jongenererande förband; Ag1+-förband innehållande etylendiamintetraättiksyra och bensetoniumklorid (Ag1+/EDTA/BC), och förband innehållande silverkväveoxid (Ag-oxisalter), vilka producerar Ag1+-, Ag2+- och Ag3+-joner för att bekämpa sårbiofilm och dess effekt på läkning. Ag1+-förband hade minimala effekter på sårbiofilm in vitro och hos möss (C57BL/6j). Däremot minskade syresatta Ag-salter och Ag1+/EDTA/BC-förband signifikant antalet livskraftiga bakterier i biofilmer in vitro och uppvisade en signifikant minskning av bakteriella och EPS-komponenter i mus-sårsbiofilmer. Dessa förband hade olika effekter på läkningen av biofilminfekterade och icke-biofilminfekterade sår, där syresatta saltförband hade mer gynnsamma effekter på reepitelisering, sårstorlek och inflammation jämfört med kontrollbehandlingar och andra silverförband. De olika fysikalisk-kemiska egenskaperna hos silverförband kan ha olika effekter på sårbiofilm och läkning, och detta bör beaktas vid val av förband för behandling av biofilminfekterade sår.
Kroniska sår definieras som "sår som inte fortskrider genom de normala läkningsstadierna på ett ordnat och snabbt sätt"1. Kroniska sår skapar en psykologisk, social och ekonomisk börda för patienter och hälso- och sjukvårdssystemet. NHS årliga utgifter för behandling av sår och associerade samsjukligheter uppskattas till 8,3 miljarder pund under 2017–182. Kroniska sår är för närvarande också ett akut problem i USA, där Medicare uppskattar den årliga kostnaden för att behandla patienter med sår till 28,1–96,8 miljarder dollar3.
Infektion är en viktig faktor som förhindrar sårläkning. Infektioner manifesterar sig ofta som biofilmer, vilka finns i 78 % av icke-läkande kroniska sår. Biofilmer bildas när mikroorganismer fäster irreversibelt vid ytor, såsom sårytor, och kan aggregeras för att bilda extracellulära polymer (EPS)-producerande samhällen. Sårbiofilm är förknippad med ett ökat inflammatoriskt svar som leder till vävnadsskada, vilket kan fördröja eller förhindra läkning4. Ökningen av vävnadsskador kan delvis bero på ökad aktivitet hos matrixmetalloproteinaser, kollagenas, elastas och reaktiva syreradikaler5. Dessutom är inflammatoriska celler och biofilmer själva höga konsumenter av syre och kan därför orsaka lokal vävnadshypoxi, vilket utarmar cellerna på det vitala syre som behövs för effektiv vävnadsreparation6.
Mogna biofilmer är mycket resistenta mot antimikrobiella medel, vilket kräver aggressiva strategier för att kontrollera biofilminfektioner, såsom mekanisk behandling följt av effektiv antimikrobiell behandling. Eftersom biofilmer kan regenereras snabbt kan effektiva antimikrobiella medel minska risken för återbildning efter kirurgisk debridering.
Silver används alltmer i antimikrobiella förband och används ofta som förstahandsbehandling för kroniskt infekterade sår. Det finns många kommersiellt tillgängliga silverförband, som alla innehåller en annan silversammansättning, koncentration och basmatris. Framsteg inom silverarmband har lett till utvecklingen av nya silverarmband. Den metalliska formen av silver (Ag0) är inert; för att uppnå antimikrobiell effektivitet måste den förlora en elektron för att bilda joniskt silver (Ag1+). Traditionella silverförband innehåller silverföreningar eller metalliskt silver som, när de utsätts för vätska, sönderfaller för att bilda Ag1+ joner. Dessa Ag1+ joner reagerar med bakteriecellen och avlägsnar elektroner från strukturella komponenter eller kritiska processer som är nödvändiga för överlevnad. Patenterad teknik har lett till utvecklingen av en ny silverförening, Ag-oxisalter (silverkväveoxid, Ag7NO11), som ingår i sårförband. Till skillnad från traditionellt silver producerar nedbrytningen av syrehaltiga salter silvertillstånd med högre valens (Ag1+, Ag2+ och Ag3+). In vitro-studier har visat att låga koncentrationer av syresatta silversalter är mer effektiva än enkeljonsilver (Ag1+) mot patogena bakterier som Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus och Escherichia coli8,9. En annan ny typ av silverförband innehåller ytterligare ingredienser, nämligen etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och bensetoniumklorid (BC), vilka rapporteras rikta in sig på biofilmens EPS och därigenom öka silverpenetrationen in i biofilmen. Dessa nya silvertekniker erbjuder nya sätt att rikta in sig på sårbiofilmer. Emellertid är effekten av dessa antimikrobiella medel på sårmiljön och infektionsoberoende läkning viktig för att säkerställa att de inte skapar en ogynnsam sårmiljö eller fördröjer läkning. Oro kring silverkytotoxicitet in vitro har rapporterats med flera silverförband10,11. In vitro-cytotoxicitet har dock ännu inte översatts till in vivo-toxicitet, och flera Ag1+-förband har visat en god säkerhetsprofil12.
Här undersökte vi effektiviteten av karboximetylcellulosaförband innehållande nya silverformuleringar mot sårbiofilm in vitro och in vivo. Dessutom utvärderades effekterna av dessa förband på immunsvar och läkning oberoende av infektion.
Alla förband som användes var kommersiellt tillgängliga. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, Storbritannien) är ett icke-antimikrobiellt 100 % karboximetylcellulosa (CMC) gelfiberförband som användes som kontrollförband i denna studie. Tre antimikrobiella CMC-silverförband utvärderades, nämligen 3M Kerracel Ag-förband (3M, Knutsford, Storbritannien), som innehåller 1,7 viktprocent syresatt silversalt (Ag7NO11) i högre valens silverjoner (Ag1+, Ag2+ och Ag3+). Under nedbrytningen av Ag7NO11 bildas Ag1+-, Ag2+- och Ag3+-joner i förhållandet 1:2:4. Aquacel Ag Extra förband innehållande 1,2 % silverklorid (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Storbritannien) 13 och Aquacel Ag + Extra förband innehållande 1,2 % silverklorid (Ag1+), EDTA och bensetoniumklorid (ConvaTec, Deeside, Storbritannien) 14.
Stammarna som användes i denna studie var Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) och Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterier odlades över natten i Muller-Hinton-buljong (Oxoid, Altrincham, Storbritannien). Övernattskulturen späddes sedan 1:100 i Mueller-Hinton-buljong och 200 µl applicerades på sterila 0,2 µm Whatman cykloporemembran (Whatman plc, Maidstone, Storbritannien) på Mueller-Hinton-agarplattor (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Storbritannien). Kolonial biofilmbildning vid 37 °C i 24 timmar. Dessa koloniala biofilmer testades med avseende på logaritmisk krympning.
Skär förbandet i 3 cm2 stora bitar och förfukta med sterilt avjoniserat vatten. Placera förbandet över kolonins biofilm på agarplattan. Var 24:e hektar biofilm avlägsnades och livskraftiga bakterier i biofilmen (CFU/ml) kvantifierades genom serieutspädning (10⁻⁹ till 10⁻⁹) i Day-Angle-neutraliseringsbuljong (Merck-Millipore). Efter 24 timmars inkubation vid 37 °C utfördes standardplatträkningar på Mueller-Hinton-agarplattor. Varje behandling och tidpunkt utfördes i triplikat och platträkningarna upprepades för varje utspädning.
Fläskmageskinn erhålls från stora vita hongrisar inom 15 minuter efter slakt i enlighet med EU:s exportstandarder. Huden rakades och rengjordes med alkoholservetter och frystes sedan vid -80 °C i 24 timmar för att devitalisera huden. Efter upptining tvättades 1 cm2 stora hudbitar tre gånger med PBS, 0,6 % natriumhypoklorit och 70 % etanol i 20 minuter varje gång. Innan epidermis avlägsnas, avlägsnas eventuell kvarvarande etanol genom att tvättas 3 gånger i steril PBS. Huden odlades i en 6-brunnsplatta med ett 0,45 μm tjockt nylonmembran (Merck-Millipore) ovanpå och 3 absorberande dynor (Merck-Millipore) innehållande 3 ml fetalt bovint serum (Sigma) kompletterat med 10 % Dulbeccos modifierade Eagle-medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Kolonialbiofilm odlades enligt beskrivningen för biofilmexponeringsstudier. Efter odling av biofilmen på membranet i 72 timmar applicerades biofilmen på hudytan med hjälp av en steril inokuleringsögla och membranet avlägsnades. Biofilmen inkuberades sedan på grisens dermis i ytterligare 24 timmar vid 37 °C för att låta biofilmen mogna och fästa vid grisens hud. Efter att biofilmen hade mognat och fäst, applicerades ett 1,5 cm2 förband, förfuktat med sterilt destillerat vatten, direkt på hudytan och inkuberades vid 37 °C i 24 timmar. Livskraftiga bakterier visualiserades genom färgning genom att jämnt applicera PrestoBlue cellviabilitetsreagens (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Storbritannien) på den apikala ytan av varje explantat och inkubera det i 5 minuter. Använd Leica DFC425 digitalkamera för att omedelbart ta bilder på Leica MZ8-mikroskopet. Områden färgade rosa kvantifierades med hjälp av Image Pro-programvara version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Svepelektronmikroskopi utfördes enligt beskrivningen nedan.
Bakterier som odlats över natten späddes 1:100 i Mueller-Hinton-buljong. 200 μl kultur tillsattes till ett sterilt 0,2 μm Whatman cykloporemembran (Whatman, Maidstone, Storbritannien) och placerades på Mueller-Hinton-agar. Biofilmplattor inkuberades vid 37 °C i 72 timmar för att möjliggöra bildning av mogen biofilm.
Efter 3 dagars biofilmmognad placerades ett 3 cm2 kvadratiskt bandage direkt på biofilmen och inkuberades vid 37 °C i 24 timmar. Efter att bandaget tagits bort från biofilmsytan tillsattes 1 ml PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA) till ytan av varje biofilm i 20 sekunder. Ytorna torkades innan färgförändringarna registrerades med en Nikon D2300 digitalkamera (Nikon UK Ltd., Kingston, Storbritannien).
Bered övernattskulturer på Mueller-Hinton-agar, överför individuella kolonier till 10 ml Mueller-Hinton-buljong och inkubera på skakapparat vid 37 °C (100 rpm). Efter inkubation över natten späddes kulturen 1:100 i Mueller-Hinton-buljong och 300 µl applicerades på ett 0,2 µm cirkulärt Whatman cykloporemembran (Whatman International, Maidstone, Storbritannien) på Mueller-Hinton-agar och inkuberades vid 37 °C inom 72 timmar. Den mogna biofilmen applicerades på såret enligt beskrivningen nedan.
Allt arbete med djur utfördes vid University of Manchester under en projektlicens godkänd av Office of Animal Welfare and Ethical Review (P8721BD27) och i enlighet med riktlinjer publicerade av Home Office enligt den reviderade ASPA från 2012. Alla författare följde ankomstriktlinjerna. Åtta veckor gamla C57BL/6j-möss (Envigo, Oxon, Storbritannien) användes för alla in vivo-studier. Mössen sövdes med isofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Storbritannien) och deras ryggytor rakades och rengjordes. Varje mus fick sedan ett 2 × 6 mm excisionssår med hjälp av en Stiefel biopsipunch (Schuco International, Hertfordshire, Storbritannien). För biofilminfekterade sår appliceras 72-timmars kolonial biofilm som odlats på membranet enligt beskrivningen ovan på sårets dermala lager med hjälp av en steril inokuleringsögla omedelbart efter skadan och kasseras. En kvadratcentimeter förband fuktas i förväg med sterilt vatten för att upprätthålla en fuktig sårmiljö. Förband applicerades direkt på varje sår och täcktes med 3M Tegaderm-film (3M, Bracknell, Storbritannien) och Mastisol flytande häftämne (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) applicerades runt kanterna för att ge ytterligare vidhäftning. Buprenorfin (Animalcare, York, Storbritannien) administrerades i en koncentration av 0,1 mg/kg som smärtstillande medel. Avliva mössen tre dagar efter skadan med hjälp av Schedule 1-metoden och ta bort, halvera och förvara sårområdet efter behov.
Hematoxylin (ThermoFisher Scientific) och eosin (ThermoFisher Scientific) färgning utfördes enligt tillverkarens protokoll. Såryta och reepitelisering kvantifierades med hjälp av Image Pro-programvara version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Vävnadssektioner avvaxades i xylen (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Storbritannien), rehydrerades med 100–50 % graderad etanol och doppades kort i avjoniserat vatten (ThermoFisher Scientific). Immunohistokemi utfördes med VectaStain Elite ABC PK-6104-kit (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien) enligt tillverkarens protokoll. Primära antikroppar mot neutrofilerna NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) och makrofagerna Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Storbritannien) späddes 1:100 i blockeringslösning och tillsattes till den skurna ytan, följt av 2 antikroppar Anti-, VectaStain ABC och Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substratkit (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien) och motfärgades med hematoxylin. Bilder togs med hjälp av ett Olympus BX43-mikroskop och en Olympus DP73 digitalkamera (Olympus, Southend-on-Sea, Storbritannien).
Hudprover fixerades i 2,5 % glutaraldehyd och 4 % formaldehyd i 0,1 M HEPES (pH 7,4) i 24 timmar vid 4 °C. Proverna dehydrerades med graderad etanol och torkades i CO2 med hjälp av en Quorum K850 kritisk punkttork (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Storbritannien) och sputterbelades med en guld-palladiumlegering med hjälp av ett Quorum SC7620 mini-sputterer/glödurladdningssystem. Proverna avbildades med ett FEI Quanta 250 svepelektronmikroskop (ThermoFisher Scientific) för att visualisera sårets centrala punkt.
Toto-1-jodid (2 μM) applicerades på den borttagna musens såryta och inkuberades i 5 minuter vid 37 °C (ThermoFisher Scientific) och behandlades med Syto-60 (10 μM) vid 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-minuters Z-stack-bilder skapades med en Leica TCS SP8.
Biologiska och tekniska replikatdata sammanställdes och analyserades med hjälp av Graphpad Prism V9-programvaran (GraphPad Software, La Jolla, CA). Envägsvariansanalys med multipla jämförelser med Dunnetts post hoc-test användes för att testa skillnader mellan varje behandling och det icke-antimikrobiella kontrollförbandet. Ett p-värde <0,05 ansågs signifikant.
Effektiviteten hos silvergel-fiberförband utvärderades först mot biofilmkolonier av Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa in vitro. Silverförband innehåller olika silverformler: traditionella silverförband producerar Ag1+-joner; silverförband, som kan producera Ag1+-joner efter tillsats av EDTA/BC, kan förstöra biofilmmatrisen och exponera bakterier för silver under den antibakteriella effekten av silverjoner15 och förband som innehåller syresatta Ag-salter som producerar Ag1+-, Ag2+- och Ag3+-joner. Dess effektivitet jämfördes med ett icke-antimikrobiellt kontrollförband tillverkat av gelade fibrer. Återstående livskraftiga bakterier i biofilmen utvärderades var 24:e timme i 8 dagar (Figur 1). På dag 5 återokulerades biofilmen med 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus eller 1,22×105P. aeruginosa för att bedöma biofilmsåterhämtningen. Jämfört med icke-antimikrobiella kontrollförband hade Ag1+ förband minimal effekt på bakteriell viabilitet i Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa biofilmer över 5 dagar. Däremot var förband innehållande syresatt Ag och Ag1+ + EDTA/BC-salter effektiva för att döda bakterier i biofilmen inom 5 dagar. Efter upprepad inokulering med planktonbakterier på dag 5 observerades ingen återställning av biofilmen (Fig. 1).
Kvantifiering av livskraftiga bakterier i biofilmer av Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa efter behandling med silverförband. Biofilmkolonier av Staphylococcus aureus och Pseudomonas aeruginosa behandlades med silverförband eller icke-antimikrobiella kontrollförband, och antalet återstående livskraftiga bakterier bestämdes var 24:e timme. Efter 5 dagar återokulerades biofilmen med 3,85×105S. Staphylococcus aureus eller 1,22×105P. Kolonier av bakterioplanktonet Pseudomonas aeruginosa bildades individuellt för att bedöma biofilmsåterhämtningen. Diagrammen visar medelvärde +/- standardfel.
För att visualisera effekten av silverförband på biofilmens livskraft applicerades förband på mogna biofilmer som odlats på svinhud ex vivo. Efter 24 timmar avlägsnas förbandet och biofilmen färgas med ett blått reaktivt färgämne, som metaboliseras av levande bakterier till en rosa färg. Biofilmer behandlade med kontrollförband var rosa, vilket indikerar närvaron av livskraftiga bakterier i biofilmen (Figur 2A). Däremot var biofilmen behandlad med Ag-oxysolförbandet huvudsakligen blå, vilket indikerar att de återstående bakterierna på ytan av grisens hud var icke-livskraftiga bakterier (Figur 2B). Blandad blå och rosa färgning observerades i biofilmer behandlade med Ag1+-innehållande förband, vilket indikerar närvaron av livskraftiga och icke-livskraftiga bakterier i biofilmen (Figur 2C), medan EDTA/BC-förband innehållande Ag1+ var övervägande blå med några rosa fläckar, vilket indikerar områden som inte påverkades av silverförbandet (Figur 2D). Kvantifiering av aktiva (rosa) och inaktiva (blå) områden visade att kontrollplåstret var 75 % aktivt (Figur 2E). Ag1+ + EDTA/BC-förband presterade på liknande sätt som syresatta Ag-saltförband, med överlevnadsgrader på 13 % respektive 14 %. Ag1+-förbandet minskade också bakteriell viabilitet med 21 %. Dessa biofilmer observerades sedan med svepelektronmikroskopi (SEM). Efter behandling med kontrollförbandet och Ag1+-förbandet observerades ett lager av Pseudomonas aeruginosa som täckte svinhuden (Figur 2F, H), medan efter behandling med Ag1+-förbandet hittades få bakterieceller och få bakterieceller under. Kollagenfibrer kan betraktas som vävnadsstrukturen i svinhud (Figur 2G). Efter behandling med Ag1+ + EDTA/BC-förband var bakterieplack och underliggande kollagenfiberplack synliga (Figur 2I).
Visualisering av Pseudomonas aeruginosa-biofilm efter behandling med silverförband. (A–D) Bakteriell viabilitet i Pseudomonas aeruginosa-biofilmer odlade på svinhud visualiserades med hjälp av PrestoBlue-viabilitetsfärgämnet 24 timmar efter behandling med silverförband eller icke-antimikrobiella kontrollförband. Levande bakterier är rosa, icke-viabel bakterier och svinhud är blå. (E) Kvantifiering av Pseudomonas aeruginosa-biofilmer odlade på svinhud (rosa fläck) med hjälp av svepelektronmikroskopi Image Pro version 10 (FI) och behandlade med ett silverförband eller ett icke-antimikrobiellt kontrollförband i 24 timmar. SEM-skalstapel = 5 µm. (J–M) Kolonialbiofilm växte på filter och färgades med PrestoBlue-reaktivfärgämne efter 24 timmars inkubation med silverförband.
För att avgöra om nära kontakt mellan förbanden och biofilmerna påverkade förbandens effektivitet behandlades koloniala biofilmer placerade på en plan yta med förbanden i 24 timmar och färgades sedan med reaktiva färgämnen. Den obehandlade biofilmen var mörkrosa till färgen (Figur 2J). Till skillnad från biofilmer behandlade med förband innehållande syresatta Ag-salter (Figur 2K) uppvisade biofilmer behandlade med förband innehållande Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC band av rosa färgning (Figur 2L,M). Denna rosa färgning indikerar närvaron av livskraftiga bakterier och är associerad med suturområdet i förbandet. Dessa insydda områden skapar döda utrymmen som gör att bakterier i biofilmen kan överleva.
För att utvärdera effektiviteten av silverförband in vivo behandlades fullhudsborttagna sår från möss infekterade med mogna S. aureus- och P. aeruginosa-biofilmer med icke-antimikrobiella kontrollförband eller silverförband. Efter 3 dagars behandling visade makroskopisk bildanalys mindre sårstorlekar vid behandling med syresatta saltförband jämfört med icke-antimikrobiella kontrollförband och andra silverförband (Figur 3A-H). För att bekräfta dessa observationer samlades sår in och såaryta och reepitelisering kvantifierades på hematoxylin- och eosin-färgade vävnadssnitt med hjälp av Image Pro-programvaran version 10 (Figur 3I-L).
Effekten av silverförband på sårytan och reepitelisering av sår infekterade med biofilmer. (A–H) Små celler infekterade med biofilmer av Pseudomonas aeruginosa (A–D) och Staphylococcus aureus (E–H) efter tre dagars behandling med ett icke-antimikrobiellt kontrollförband, ett syresatt Ag-saltförband, ett Ag1+-förband och ett Ag1+-förband. Representativa makroskopiska bilder. Sår från möss med Ag1+ + EDTA/BC-förband. (IL) Representativ Pseudomonas aeruginosa-infektion, histologiska snitt färgade med hematoxylin och eosin, användes för att kvantifiera sårarea och epitelregenerering. Kvantifiering av sårarea (M, O) och procentuell reepitelisering (N, P) av sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa (M, N) och Staphylococcus aureus (O, P) biofilmer (per behandlingsgrupp n = 12). Diagrammen visar medelvärde +/- standardfel. * betyder p = < 0,05 ** betyder p = < 0,01; Makroskopisk skala = 2,5 mm, histologisk skala = 500 µm.
Kvantifiering av såaryta i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa biofilm (Figur 3M) visade att sår behandlade med Ag-oxisalter hade en genomsnittlig sårstorlek på 2,5 mm2, medan det icke-antimikrobiella kontrollförbandet hade en genomsnittlig sårstorlek på 3,1 mm2, vilket inte är sant. uppnådde statistisk signifikans (Figur 3M). p = 0,423). Sår behandlade med Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC visade ingen minskning av såryta (3,1 mm2 respektive 3,6 mm2). Behandling med syresatt Ag-saltförband främjade reepitelisering i större utsträckning än det icke-antimikrobiella kontrollförbandet (34 % respektive 15 %; p = 0,029) och Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC (10 % respektive 11 %) (Figur 3N).
Liknande trender i sårarea och epitelregenerering observerades i sår infekterade med S. aureus-biofilmer (Figur 3O). Förband innehållande syresatta silversalter minskade sårarea (2,0 mm2) med 23 % jämfört med kontrollförbandet utan antimikrobiella medel (2,6 mm2), även om denna minskning inte var signifikant (p = 0,304) (Fig. 3O). Dessutom minskade sårarea i Ag1+-behandlingsgruppen något (2,4 mm2), medan såret som behandlades med Ag1+ + EDTA/BC-förband inte minskade sårarea (2,9 mm2). Syresalter av Ag främjade också reepitelisering av sår infekterade med S. aureus-biofilm (31 %) i större utsträckning än de som behandlades med icke-antimikrobiella kontrollförband (12 %, p = 0,003) (Figur 3P). Ag1+ förband (16 %, p = 0,903) och Ag+1 + EDTA/BC-förband (14 %, p = 0,965) visade nivåer av epitelial regenerering liknande kontrollgruppen.
För att visualisera effekten av silverförband på biofilmsmatrisen utfördes Toto 1- och Syto 60-jodidfärgning (Fig. 4). Toto 1-jodid är ett cellogenomträngligt färgämne som kan användas för att noggrant visualisera extracellulära nukleinsyror, vilka finns i överflöd i EPS i biofilmer. Syto 60 är ett cellgenomträngligt färgämne som används som motfärgning16. Observationer av Toto 1- och Syto 60-jodid i sår inokulerade med biofilmer av Pseudomonas aeruginosa (Figur 4A-D) och Staphylococcus aureus (Figur 4I-L) visade att efter 3 dagars förbandsbehandling var EPS i biofilmen signifikant reducerad. EPS, innehållande syresatta salter Ag och Ag1+ + EDTA/BC, minskade signifikant cellfritt DNA i sår inokulerade med Pseudomonas aeruginosa men var mindre effektiva i sår inokulerade med Staphylococcus aureus.
In vivo-avbildning av sårbiofilm efter 3 dagars behandling med kontroll- eller silverförband. Konfokala bilder av Pseudomonas aeruginosa (A–D) och Staphylococcus aureus (I–L) färgade med Toto 1 (grön) för att visualisera extracellulära nukleinsyror, en komponent i extracellulära biofilmpolymerer. För att färga intracellulära nukleinsyror, använd Syto 60 (röd). syror. P. Svepelektronmikroskopi av sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa (E–H) och Staphylococcus aureus (M–P) biofilmer efter 3 dagars behandling med kontroll- och silverförband. SEM-skalstapel = 5 µm. Konfokal avbildningsskalstapel = 50 µm.
Svepelektronmikroskopi visade att möss som inokulerats med biofilmkolonier av Pseudomonas aeruginosa (Figur 4E-H) och Staphylococcus aureus (Figur 4M-P) hade signifikant färre bakterier i sina sår efter 3 dagars behandling med enbart silverförband.
För att utvärdera effekten av silverförband på sårinflammation hos biofilminfekterade möss, färgades sektioner av biofilminfekterade sår behandlade med kontroll- eller silverförband i 3 dagar immunhistokemiskt med antikroppar specifika för neutrofiler och makrofager. Kvantitativ bestämning av neutrofiler och makrofager internt. granulationsvävnad. Figur 5). Alla silverförband minskade antalet neutrofiler och makrofager i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa jämfört med icke-antimikrobiella kontrollförband efter tre dagars behandling. Behandling med det syresatta silversaltförbandet resulterade dock i en större minskning av neutrofiler (p = <0,0001) och makrofager (p = <0,0001) jämfört med andra testade silverförband (Figur 5I,J). Även om Ag1+ + EDTA/BC hade en större effekt på sårbiofilmen, minskade det neutrofil- och makrofagnivåerna i mindre utsträckning än Ag1+-förbandet. Måttliga sår infekterade med S. aureus biofilm observerades också efter förband med Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) och Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisoler jämfört med kontrollgruppen. Liknande trender observeras för neutropeniförband (Fig. 5K). Emellertid visade endast det syresatta Ag-saltförbandet en signifikant minskning av antalet makrofager i granulationsvävnaden jämfört med kontrollgruppen i sår infekterade med S. aureus biofilmer (p = 0,0339) (Figur 5L).
Neutrofiler och makrofager kvantifierades i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa- och Staphylococcus aureus-biofilmer efter 3 dagars behandling med icke-antimikrobiella kontroll- eller silverförband. Neutrofiler (AD) och makrofager (EH) kvantifierades i vävnadssnitt färgade med antikroppar specifika för neutrofiler eller makrofager. Kvantifiering av neutrofiler (I och K) och makrofager (J och L) i sår infekterade med Pseudomonas aeruginosa- (I och J) och Staphylococcus aureus (K & L) biofilmer. N = 12 per grupp. Diagrammen visar medelvärde +/- standardfel, signifikansvärden jämfört med icke-antibakteriellt kontrollförband, * betyder p = < 0,05, ** betyder p = < 0,01; *** betyder p = < 0,001; indikerar p = <0,0001).
Vi utvärderade sedan effekten av silverförband på infektionsoberoende läkning. Icke-infekterade excisionssår behandlades med ett icke-antimikrobiellt kontrollförband eller ett silverförband i 3 dagar (Figur 6). Bland de testade silverförbanden var det endast sår behandlade med det syresatta saltförbandet som verkade mindre på makroskopiska bilder än sår behandlade med kontrollgruppen (Figur 6A-D). Kvantifiering av sårarea med hjälp av histologisk analys visade att den genomsnittliga sårarea efter behandling med Ag-oxysolförbandet var 2,35 mm2 jämfört med 2,96 mm2 för sår behandlade med kontrollgruppen, men denna skillnad nådde inte statistisk signifikans (p = 0,488) (Fig. 6I). Däremot observerades ingen minskning av sårarea efter behandling med Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) eller Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) förband jämfört med kontrollgruppen. Ökad epitelregenerering observerades med Ag-oxysolförbandet jämfört med kontrollgruppen (30 % respektive 22 %), även om detta inte nådde signifikans (p = 0,067), är detta ganska signifikant och bekräftar tidigare resultat. Ett förband med oxysoler främjar reepitelisering. -Epitelisering av oinfekterade sår17. Däremot hade behandling med Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC-förband ingen effekt eller visade minskad reepitelisering jämfört med kontrollgruppen.
Effekt av silversårförband på sårläkning hos oinfekterade möss med fullständig resektion. (AD) Representativa makroskopiska bilder av sår efter tre dagars behandling med ett icke-antimikrobiellt kontrollförband och ett silverförband. (EH) Representativa sårsnitt färgade med hematoxylin och eosin. Kvantifiering av sårarea (I) och procentuell reepitelisering (J) beräknades från histologiska snitt vid sårets mittpunkt med hjälp av bildanalysprogramvara (n = 11–12 per behandlingsgrupp). Diagrammen visar medelvärde +/- standardfel. * medelvärden p = <0,05.
Silver har en lång historia av användning som antimikrobiell behandling vid sårläkning, men de många olika formuleringarna och leveransmetoderna kan resultera i skillnader i antimikrobiell effekt 18. Dessutom är antibiofilmegenskaperna hos specifika silverleveranssystem inte helt förstådda. Även om värdens immunsvar är relativt effektivt mot planktoniska bakterier, är det generellt mindre effektivt mot biofilmer 19. Planktoniska bakterier fagocytoseras lätt av makrofager, men inom biofilmer utgör aggregerade celler ytterligare problem genom att begränsa värdsvaret i den utsträckning att immunceller kan genomgå apoptos och frigöra proinflammatoriska faktorer för att förbättra immunsvaret 20. Det har observerats att vissa leukocyter kan penetrera biofilmer 21 men inte kan fagocytera bakterier när detta försvar är komprometterat 22. En helhetssyn bör användas för att stödja värdens immunsvar mot sårbiofilminfektion. Sårdebridering kan fysiskt störa biofilmen och ta bort det mesta av biobördan, men värdens immunsvar kan vara ineffektivt mot kvarvarande biofilm, särskilt om värdens immunsvar är komprometterat. Antimikrobiella behandlingar som silverförband kan således stödja värdens immunsvar och eliminera biofilminfektioner. Sammansättning, koncentration, löslighet och leveranssubstrat kan påverka silvrets antimikrobiella effektivitet. Under senare år har framsteg inom silverbearbetningsteknik gjort dessa förband mer effektiva9,23. I takt med att silverförbandstekniken utvecklas är det viktigt att förstå effektiviteten hos dessa förband för att kontrollera sårinfektion och, ännu viktigare, effekten av dessa potenta former av silver på sårmiljön och läkningen.
I denna studie jämförde vi effektiviteten hos två avancerade silverförband med konventionella silverförband som producerar Ag1+-joner mot biofilmer med hjälp av olika in vitro- och in vivo-modeller. Vi utvärderade också effekten av dessa förband på sårmiljön och infektionsoberoende läkning. För att minimera påverkan av leveransmatrisen bestod alla testade silverförband av karboximetylcellulosa.
Vår preliminära utvärdering av dessa silverförband mot koloniala biofilmer av Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus visar att, till skillnad från traditionella Ag1+-förband, är två avancerade silverförband, Ag1+ + EDTA/BC och syresatta Ag-salter, effektiva vid 5. De dödar effektivt biofilmbakterier inom några dagar. Dessutom förhindrar dessa förband återbildning av biofilm vid upprepad exponering för planktonbakterier. Ag1+-förbandet innehöll silverklorid, samma silverförening och basmatris som Ag1+ + EDTA/BC, och hade en begränsad effekt på bakteriell livskraft i biofilmen under samma period. Observationen att ett Ag1+ + EDTA/BC-förband var mer effektivt mot biofilm än ett Ag1+-förband bestående av samma matris och en silverförening stöder uppfattningen att ytterligare ingredienser krävs för att öka silverkloridens effektivitet mot biofilm, vilket har rapporterats på annat håll15. Dessa resultat stöder idén att BC och EDTA spelar en ytterligare roll som bidrar till förbandets totala effektivitet och att avsaknaden av denna komponent i Ag1+ förband kan ha bidragit till att det inte gick att påvisa in vitro-effekt. Vi fann att syresatta Ag-saltförband som producerar Ag2+ och Ag3+ joner uppvisade starkare antibakteriell effekt än Ag1+ och på nivåer som liknar Ag1+ + EDTA/BC. På grund av den höga redoxpotentialen är det dock oklart hur länge Ag3+ joner förblir aktiva och effektiva mot sårbiofilmer och därför förtjänar ytterligare studier. Dessutom finns det många olika förband som genererar Ag1+ joner som inte testades i denna studie. Dessa förband består av olika silverföreningar, koncentrationer och basmatriser, vilket kan påverka leveransen av Ag1+ joner och deras effektivitet mot biofilmer. Det är också värt att notera att det finns många olika in vitro- och in vivo-modeller som används för att utvärdera effektiviteten hos sårförband mot biofilmer. Typen av modell som används, liksom salt- och proteininnehållet i mediet som används i dessa modeller, kommer att påverka förbandets effektivitet. I vår in vivo-modell lät vi biofilmen mogna in vitro och överförde den sedan till sårets dermala yta. Värdmusens immunsvar är relativt effektivt mot planktonbakterier som appliceras på såret, varigenom en biofilm bildas när såret läker. Tillsatsen av mogen biofilm till ett sår begränsar effektiviteten av värdens immunsvar på biofilmbildning genom att tillåta den mogna biofilmen att etablera sig i såret innan läkningen kan börja. Således tillåter vår modell oss att utvärdera effektiviteten av antimikrobiella förband på mogna biofilmer innan sår börjar läka.
Vi fann också att förbandets passform påverkade silverförbandens effektivitet på in vitro-odlade biofilmer och grishud. Nära kontakt med såret anses avgörande för förbandets antimikrobiella effektivitet24,25. Förband som innehöll syresatta Ag-salter var i nära kontakt med mogna biofilmer, vilket resulterade i en signifikant minskning av antalet livskraftiga bakterier i biofilmen efter 24 timmar. Däremot, vid behandling med Ag1+ och Ag1+ + EDTA/BC-förband, fanns ett betydande antal livskraftiga bakterier kvar. Dessa förband innehåller suturer längs hela förbandets längd, vilket skapar döda utrymmen som förhindrar nära kontakt med biofilmen. I våra in vitro-studier förhindrade dessa kontaktfria områden att livskraftiga bakterier i biofilmen dödades. Vi bedömde bakteriell livskraft först efter 24 timmars behandling. Med tiden, när förbandet blir mer mättat, kan det finnas mindre döda utrymmen, vilket minskar arean för dessa livskraftiga bakterier. Detta belyser dock vikten av förbandets sammansättning, inte bara typen av silver i förbandet.
Även om in vitro-studier är användbara för att jämföra effektiviteten hos olika silverteknologier, är det också viktigt att förstå effekterna av dessa förband på biofilmer in vivo, där värdvävnad och immunsvar bidrar till förbandens effektivitet mot biofilmer. Effekten av dessa förband på sårbiofilmer observerades med hjälp av svepelektronmikroskopi och EPS-färgning av biofilmen med intracellulära och extracellulära DNA-färgämnen. Vi fann att efter 3 dagars behandling var alla förband effektiva för att minska cellfritt DNA i biofilminfekterade sår, men Ag1+-förbandet var mindre effektivt i Staphylococcus aureus-infekterade sår. Svepelektronmikroskopi visade också att signifikant färre bakterier fanns i sår behandlade med silverförbanden, även om detta var mer uttalat med det syresatta Ag-saltförbandet och Ag1+ + EDTA/BC-förbandet jämfört med Ag1+-förbandet. Dessa data visar att de testade silverförbanden hade varierande grad av inverkan på biofilmstrukturen, men inget av silverförbanden kunde utrota biofilmen, vilket stöder behovet av en helhetssyn på behandling av sårbiofilminfektioner; användning av silverarmband. Behandlingen föregås av fysisk debridement för att avlägsna det mesta av biofilmen.
Kroniska sår är ofta i ett tillstånd av svår inflammation, med överskott av inflammatoriska celler som stannar kvar i sårvävnaden under en längre tid, vilket orsakar vävnadsskador och utarmar det syre som behövs för effektiv cellmetabolism och funktion i såret26. Biofilmer förvärrar denna fientliga sårmiljö genom att negativt påverka läkningen på en mängd olika sätt, inklusive hämning av cellproliferation och migration och aktivering av proinflammatoriska cytokiner27. I takt med att silverförband blir mer effektiva är det viktigt att förstå vilken inverkan de har på sårmiljön och läkningen.
Intressant nog, även om alla silverförband påverkade biofilmens sammansättning, var det endast syresatta silversaltförband som ökade reepiteliseringen av dessa infekterade sår. Dessa data stöder våra tidigare fynd17 och de från Kalan et al. (2017)28, som visade goda säkerhets- och toxicitetsprofiler för syresatta silversalter, eftersom lägre koncentrationer av silver var effektiva mot biofilmer.
Vår aktuella studie belyser skillnaderna i silverteknik mellan antimikrobiella silverförband och vilken inverkan denna teknik har på sårmiljön och infektionsoberoende läkning. Dessa resultat skiljer sig dock från tidigare studier som visat att Ag1+ + EDTA/BC-förband förbättrade läkningsparametrarna för skadade kaninöron in vivo. Detta kan dock bero på skillnader i djurmodeller, mättider och bakteriella appliceringsmetoder29. I detta fall togs sårmätningar 12 dagar efter skadan för att låta förbandets aktiva ingredienser verka på biofilmen under en längre tidsperiod. Detta stöds av en studie som visade att kliniskt infekterade bensår behandlade med Ag1+ + EDTA/BC initialt ökade i storlek efter en veckas behandling, och sedan under de kommande 3 veckornas behandling med Ag1+ + EDTA/BC och inom 4 veckor efter användning av icke-antimikrobiella läkemedel. CMC-förband för att minska sårstorleken30.
Vissa former och koncentrationer av silver har tidigare visat sig vara cytotoxiska in vitro 11 , men dessa in vitro-resultat leder inte alltid till negativa effekter in vivo. Dessutom har framsteg inom silverteknik och en bättre förståelse av silverföreningar och koncentrationer i förband lett till utvecklingen av många säkra och effektiva silverförband. Men i takt med att silverförbandstekniken utvecklas är det viktigt att förstå hur dessa förband påverkar sårmiljön 31, 32, 33. Det har tidigare rapporterats att den ökade graden av reepitelisering motsvarar en ökad andel antiinflammatoriska M2-makrofager jämfört med den proinflammatoriska M1-fenotypen. Detta noterades i en tidigare musmodell där silverhydrogel-sårförband jämfördes med silversulfadiazin och icke-antimikrobiella hydrogeler 34.
Kroniska sår kan uppvisa kraftig inflammation och det har observerats att förekomsten av överskott av neutrofiler kan vara skadligt för sårläkning35. I en studie på möss med neutrofilbrist fördröjde förekomsten av neutrofiler reepitelialiseringen. Förekomsten av överskott av neutrofiler leder till höga nivåer av proteaser och reaktiva syreradikaler, såsom superoxid och väteperoxid, vilka är associerade med kroniska och långsamt läkande sår37,38. Likaså kan en ökning av makrofagantalet, om det inte är kontrollerat, leda till fördröjd sårläkning39. Denna ökning är särskilt viktig om makrofager inte kan övergå från en proinflammatorisk fenotyp till en pro-läkande fenotyp, vilket resulterar i att såren inte lämnar den inflammatoriska läkningsfasen40. Vi observerade en minskning av neutrofiler och makrofager i biofilminfekterade sår efter 3 dagars behandling med enbart silverförband, men minskningen var mer uttalad med syresatta saltförband. Denna minskning kan vara ett direkt resultat av immunsvaret mot silver, ett svar på minskad biobörda, eller att såret befinner sig i ett senare läkningsstadium och därför minskar antalet immunceller i såret. Att minska antalet inflammatoriska celler i såret kan upprätthålla en miljö som gynnar sårläkning. Verkningsmekanismen för hur Ag-oxisalter främjar infektionsoberoende läkning är oklar, men Ag-oxisalters förmåga att producera syre och förstöra skadliga nivåer av väteperoxid, en mediator av inflammation, kan förklara detta och kräver ytterligare studier17.
Kroniska, icke-läkande infekterade sår utgör ett problem för både läkare och patienter. Även om många förband påstår sig ha antimikrobiell effekt, fokuserar forskningen sällan på andra viktiga faktorer som påverkar sårets mikromiljö. Denna studie visar att olika silverteknologier har olika antimikrobiell effekt och, viktigast av allt, olika effekter på sårmiljön och läkning, oberoende av infektion. Även om dessa in vitro- och in vivo-studier visar effektiviteten hos dessa förband vid behandling av sårinfektioner och främjande av läkning, behövs randomiserade kontrollerade studier för att utvärdera effektiviteten hos dessa förband i kliniken.
De dataset som använts och/eller analyserats under den aktuella studien är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.
Publiceringstid: 15 juli 2024